【摘要】： 嚴重創(chuàng)傷、大手術后及其他危重病人往往伴有嚴重的革蘭氏陰性菌感染,最終可發(fā)展為內毒素血癥,甚至內毒素休克,是目前危重癥治療領域非常棘手的問題。革蘭氏陰性菌的致病物質基礎是被稱為內毒素的脂多糖(LPS),近年研究證明,LPS主要通過一種跨膜蛋白Toll-like receptor 4(TLR4)將炎癥信號傳入胞內,進一步激發(fā)一系列炎癥反應。若能在TLR4水平阻斷該信號轉導通路,那么就有可能抑制過度的炎癥反應。基于此,本實驗擬通過真核系統(tǒng)表達TLR4胞外段,并觀察它對LPS所致炎癥反應的影響。 方法:首先通過PCR技術從攜帶TLR4全長cDNA的質粒pCMV-TLR4上擴增獲得TLR4胞外段cDNA,將后者克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+),構建真核表達質粒pcDNA3.1(+)-eTLR4,通過酶切分析及測序給予鑒定。然后將pcDNA3.1(+)-eTLR4通過脂質體轉染法轉入HEK293細胞,在mRNA水平觀察TLR4胞外基因的表達。最后我們用G418篩選穩(wěn)定表達TLR4胞外段HEK293細胞,用培養(yǎng)液上清作用于誘導分化成熟的U937細胞,通過ELISA觀察該細胞TNF-α的分泌變化。 結果:1.從攜帶TLR4全長cDNA的質粒pCMV-TLR4上成功擴增獲得TLR4胞外段cDNA,片段大小1.8kb,與理論值一致。2.將TLR4胞外段cDNA克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+),通過酶切分析及測序證明成功構建了真核表達質粒cDNA3.1(+)-eTLR4,其插入片段的堿基序列、兩端的酶切位點及讀碼框完全正確。3.通過脂質體轉染法,將pcDNA3.1(+)-eTLR4和pcDNA3.1(+)分別轉染HEK293細胞后,在mRNA水平證明:前者有TLR4胞外基因表達,而后者無任何表達。4.LPS能刺激誘導分化成熟的U937細胞TNF-α的分泌量增加(p0.01),其分泌量隨LPS劑量增加而增加。5.穩(wěn)定表達TLR4胞外段的HEK293細胞培養(yǎng)液上清能減少誘導分化成熟的U937細胞TNF-α的分泌量(p0.01),并隨劑量增加而降低;而穩(wěn)定表達TLR4胞外段的HEK293細胞裂解液對TNF-α的分泌無明顯影響;同時轉染空載體的細胞培養(yǎng)液上清對TNF-α的分泌亦無明顯影響。6.細胞培養(yǎng)液上清在不同時刻給予,對誘導分化成熟的U937細胞TNF-α的分泌量有所影響,隨給藥時間延遲TNF-α的分泌量有逐漸降低的趨勢。
[Abstract]:Severe trauma, major surgery and other critical patients are often accompanied by severe Gram-negative bacteria infection, which can eventually develop into endotoxemia or even endotoxic shock, which is a very difficult problem in the field of critical and severe treatment at present. The pathogenic substance of Gram-negative bacteria is the lipopolysaccharide (LPS),) which is called endotoxin. It has been proved in recent years that LPS transmembrane protein Toll-like receptor 4 (TLR4) sends the inflammatory signal into the cell and further stimulates a series of inflammatory reactions. If the signal transduction pathway is blocked at TLR4 level, it may inhibit excessive inflammation. Based on this, we intend to express the extracellular segment of TLR4 through eukaryotic system and observe its effect on the inflammatory response induced by LPS. Methods: firstly, the extracellular cDNA, of TLR4 was amplified from the plasmid pCMV-TLR4 carrying the full-length cDNA of TLR4 by PCR technique. The latter was cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (), to construct the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 () -eTLR4,. The identification was carried out by restriction enzyme digestion and sequencing. Then pcDNA3.1 ()-eTLR4 was transfected into HEK293 cells by liposome transfection and the expression of TLR4 extracellular genes was observed at the mRNA level. Finally, we used G418 to screen the HEK293 cells stably expressing the extracellular segment of TLR4. The supernatant was used to induce the differentiation of U937 cells. The secretion of TNF- 偽 was observed by ELISA. Results: 1. The extracellular cDNA, fragment of TLR4 was amplified successfully from the plasmid pCMV-TLR4 carrying the full-length cDNA of TLR4, which was 1.8kb in size, which was in agreement with the theoretical value of 2.2. The extracellular cDNA of TLR4 was cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (),. It was proved by restriction endonuclease analysis and sequencing that the base sequence of the eukaryotic expression plasmid cDNA3.1 ()-eTLR4, was successfully constructed. The endonuclease sites and reading frames are completely correct. 3. After transfection of pcDNA3.1 ()-eTLR4 and pcDNA3.1 () into HEK293 cells by liposome transfection, it was proved at mRNA level that the former had extracellular TLR4 gene expression. 4.LPS stimulated the secretion of TNF- 偽 in differentiated U937 cells (p0.01), and the secretion of TNF- 偽 increased with the increase of LPS dose. The supernatant of HEK293 cells stably expressing extracellular segments of TLR4 decreased the secretion of TNF- 偽 in U937 cells (p0.01), and decreased with the increase of dosage. However, the HEK293 cell lysate, which stably expressed the extracellular segment of TLR4, had no significant effect on the secretion of TNF- 偽, and the supernatant of the cell culture medium transfected with empty vector had no significant effect on the secretion of TNF- 偽. The supernatant of cell culture medium at different time affected the secretion of TNF- 偽 in U937 cells, and the secretion of TNF- 偽 decreased gradually with the delay of drug administration.
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R362

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10 傅穎s，

本文編號：2350890