【摘要】： 背景軟組織在維持面部和軀體輪廓中起著重要作用,軟組織缺損的修復(fù)重建目前仍然是整形外科面臨的挑戰(zhàn)之一,嚴(yán)重的深度燒傷,腫瘤切除術(shù)后,半側(cè)顏面萎縮等先天性缺損疾病等都存在軟組織缺損的問題。其中脂肪組織缺損是其主要表現(xiàn)之一。自Neuber在1893年完成了第1例用多個(gè)自體游離的小脂肪塊填充軟組織缺損的脂肪移植手術(shù)取得滿意的療效后,到20世紀(jì)初脂肪移植手術(shù)甚為流行。因此項(xiàng)技術(shù)操作簡(jiǎn)單,不需附加切口,不留瘢痕,組織相容性好,所以在整形及美容外科的許多方面得到廣泛的應(yīng)用.但是因?yàn)榇嬖谥炯?xì)胞成活率低,較高的吸收率和纖維化問題,臨床效果并不理想.另外脂肪移植后的吸收率的檢查缺乏一個(gè)客觀的標(biāo)準(zhǔn)。 對(duì)前脂肪細(xì)胞性質(zhì)的認(rèn)識(shí)為將脂肪視為可移植的組織材料奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。前脂肪細(xì)胞不含脂滴,體積小,有促血管生成特性,在細(xì)胞的收集與移植過程中比成熟的脂肪細(xì)胞更能耐受缺血與創(chuàng)傷,在脂肪移植后的缺血期,使單個(gè)細(xì)胞比塊狀脂肪更易通過細(xì)胞融合而成活.如果我們利用現(xiàn)有的理論,首先得到患者的前體脂肪細(xì)胞,然后在體外促進(jìn)其增殖分化成成熟的脂肪細(xì)胞,就可以隨時(shí)用它來填充自身的軟組織缺損。這就等于建立了一個(gè)無限量的脂肪組織庫(kù),我們可以根據(jù)需要隨時(shí)取貨。目前對(duì)人前脂肪細(xì)胞的生物學(xué)特性還處于研究階段。 目的 1、通過臨床研究建立一個(gè)客觀脂肪移植成活率的影象學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn),并借此觀察臨床bFGF對(duì)注射脂肪成活率的作用; 2、觀察bFGF對(duì)體外培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。 3、觀察bFGF對(duì)移植于裸鼠體內(nèi)前脂肪細(xì)胞成脂的影響。為脂肪細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用開辟一條新的思路。 方法 (一)1、無菌條件下抽吸的脂肪組織消化、用酶消化法,體外分離培養(yǎng)Pra,并進(jìn)行傳代擴(kuò)增;觀察細(xì)胞形態(tài)。 2、將第二代細(xì)胞按10~4個(gè)/孔(含100μl培養(yǎng)液)接種于96孔板(每板分2組,每組3×8孔,其中1組為對(duì)照),實(shí)驗(yàn)組加入生長(zhǎng)因子(bFGF10 ng/ml),每天以MTT法觀測(cè)細(xì)胞增殖情況,繪制生長(zhǎng)曲線。 3、將第二代細(xì)胞按104個(gè)/孔(含100μl培養(yǎng)液)接種于96孔板(每板分2組,每組3×8孔,其中1組為對(duì)照)。培養(yǎng)2天待細(xì)胞融合后后加入分化培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加入生長(zhǎng)因子(bFGF10 ng/ml),對(duì)照組為僅含10%小牛血清的人前脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)液。測(cè)定脂肪細(xì)胞甘油三酯的合成量。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。 (二)1、制備前脂肪細(xì)胞懸液:第二代前脂肪細(xì)胞以3×10~4/ml密度接種培養(yǎng)瓶中,在37℃,5%CO_2培養(yǎng),第2天,換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后,胰酶消化,以普通培養(yǎng)液制成3×10~4/ml細(xì)胞懸液,分成兩組,A組內(nèi)含10 ng/ml重組人b FGF;B組不含重組人b FGF。 2、ADM用15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡24h待用。 3、細(xì)胞生物支架復(fù)合體的制備:將經(jīng)15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡過的片狀生物支架置于培養(yǎng)板內(nèi),每孔1片,共12孔。實(shí)驗(yàn)分為三組,每組4孔,a組加入A組細(xì)胞懸液100ul;b組加入B組細(xì)胞懸液100ul;c組加入不含細(xì)胞的普通培養(yǎng)液100ul.各組液體由移液槍均勻滴在ADM表面,靜置10分鐘。 4、細(xì)胞支架復(fù)合體植入裸鼠皮下,8周后取材。 5、組織學(xué)檢查:將上述標(biāo)本材料經(jīng)10%中性甲醛固定后,石蠟包埋并切片,HE染色,觀察其組織學(xué)變化。 6、在200倍光鏡下,每張切片選5個(gè)視野,記數(shù)生成脂肪細(xì)胞數(shù)目,取平均植(x±s表示)代表脂肪密度,比較三組間差異。 7、免疫組織化學(xué)檢查鑒定脂肪組織來源。(三)1、2006年1月-2007年1月,選取女性雙側(cè)顳部凹陷要求手術(shù)者20例行顆粒脂肪注射填充術(shù)。 2、自體脂肪顆粒的制備:采用注射器針式吸脂法(16號(hào)針頭),于皮下脂肪層放射狀吸取足量脂肪混懸液,過濾、沖洗,每20ml脂肪顆粒中注入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2000U及慶大霉素8000U,混勻備用。 3、脂肪顆粒的注射:注射總量約為預(yù)測(cè)脂肪量×150%+局部浸潤(rùn)麻藥量。 4、注射手術(shù)結(jié)束后第二天、三月分別照相,CT成像。 5、3月后技算脂肪吸收率,判斷療效。 結(jié)果 (一)1、重組人bFGF對(duì)前脂肪細(xì)胞有明顯的促增殖作用,與對(duì)照組比較第1,2天差異不明顯,隨時(shí)間的推移,第6-7天到達(dá)高峰,與對(duì)照組比較差異顯著;bFGF刺激前脂肪細(xì)胞倍增時(shí)間提前12小時(shí)。 2、加入bFGF(10 ng/ml)的前脂肪細(xì)胞分化提前,細(xì)胞內(nèi)合成的脂肪小滴更多;誘導(dǎo)分化第3天時(shí),前脂肪細(xì)胞中甘油三酯總量輕度升高,到分化6天和9天時(shí),甘油三酯總量明顯升高,與對(duì)照組相比差異均有顯著性 (二)1、8周后取材的細(xì)胞支架復(fù)合體HE染色顯示 (1)c組,在裸鼠皮下,脫細(xì)胞異體真皮支架表面和真皮內(nèi)都沒有觀察到脂肪細(xì)胞: (2)b組,在裸鼠皮下,脫細(xì)胞異體真皮支架表面和真皮內(nèi)有脂肪細(xì)胞存活,但脂肪細(xì)胞散在,密度較a組低: (3)a組,成活的脂肪細(xì)胞較多,在真皮表面有成團(tuán)的脂肪細(xì)胞,脂肪細(xì)胞可深入真皮內(nèi)。在放大200倍鏡下a組脂肪細(xì)胞的數(shù)目(77±56/視野)較b組(66±44/視野)增加明顯。支架內(nèi)有新生血管形成。 2、免疫組化顯示a、b組組都有陽(yáng)性細(xì)胞染色,證明存活的脂肪細(xì)胞是人源性的。a組陽(yáng)性細(xì)胞較b組陽(yáng)性細(xì)胞多,c組無陽(yáng)性細(xì)胞染色。 (三)1、本組20例40個(gè)凹陷部位,每部位每次脂肪顆粒注射量10ml～16ml,平均11ml術(shù),后無感染、血腫、脂肪液化、脂肪栓塞發(fā)生,1-3月內(nèi)均可見移植物部分吸收體積變小,3個(gè)月后外形基本穩(wěn)定。一次注射后優(yōu)16個(gè)部位(40%),良20個(gè)部位(50%),差4個(gè)部位(10%)。 2、CT檢測(cè)3月后注射脂肪吸收率27%±5.6% 結(jié)論 1、b FGF對(duì)體外培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞的有明顯的促增殖分化作用。 2、b FGF對(duì)移植于裸鼠體內(nèi)的人前脂肪細(xì)胞有明顯的促成脂作用。其可能原因?yàn)閎FGF促進(jìn)了脂肪細(xì)胞的在體內(nèi)的增殖和分化;bFGF縮短了移植組織內(nèi)形成血管的時(shí)間,使移植的脂肪細(xì)胞縮短了體內(nèi)缺血缺氧的時(shí)間,有更多的脂肪細(xì)胞存活。 3、脫細(xì)胞異體真皮是一種良好的脂肪組織化工程的支架材料 4、bFGF能夠提高臨床脂肪移植的成活率。 5、計(jì)算機(jī)輔助CT成像技術(shù)檢測(cè)注射脂肪后吸收率這一無創(chuàng)方法客觀、準(zhǔn)確,值得在臨床研究中推廣。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329;R622

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2352081