【摘要】： 14-3-3zeta蛋白是14-3-3蛋白家族中的一個(gè)成員，通常以二聚體的形式存在。14-3-3蛋白是真核細(xì)胞中普遍存在的高度保守的蛋白家族，由7個(gè)亞型組成。14-3-3zeta蛋白能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)配體，是信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要接頭蛋白。14-3-3zeta蛋白可以和受體、激酶等多種配體結(jié)合，通過(guò)相互作用調(diào)節(jié)它們的生物學(xué)活性。14-3-3蛋白是一種重要的抑制凋亡因子，近年來(lái)的研究表明14-3-3zeta與糖尿病腎病、抑郁癥、老年性癡呆病等多種疾病有關(guān)，但其相關(guān)機(jī)理仍未完全闡明。有關(guān)報(bào)道顯示14-3-3zeta蛋白在乳腺癌、肝癌中過(guò)量表達(dá)，可能成為腫瘤診斷中的一種新型潛在標(biāo)記物 制備14-3-3zeta特異性抗體將為14-3-3zeta蛋白功能的深入研究和腫瘤診斷提供有利的工具。14-3-3蛋白家族高度保守，各亞型之間的同源性超過(guò)70％。目前所報(bào)道的14-3-3zeta抗體均未對(duì)14-3-3蛋白的7個(gè)亞型進(jìn)行特異性鑒定，，無(wú)法說(shuō)明它的特異性。本論文旨在制備抗14-3-zeta蛋白的特異性抗體。為此，我們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究。 (1)14-3-3zeta合成多肽抗原的制備：通過(guò)生物信息學(xué)14-3-3zeta蛋白氨基酸序列的同源性、疏水性、抗原決定簇等進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)分析的結(jié)果進(jìn)行處理，最終確定14-3-3zeta蛋白二序列位置為230-240的DTQGDEAEAG氨基酸序列為免疫肽段。該段多肽的特異性較大，親水性較強(qiáng)，但免疫原性一般。為增強(qiáng)該肽段的免疫原性，將其鉸鏈在BSA上，獲得合成抗原。 (2)14-3-3zeta重組抗原的制備：以質(zhì)粒pDEST17為表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)14-3-3zeta基因融合蛋白的表達(dá)，通過(guò)His-鎳親和基質(zhì)純化14-3-3zeta蛋白。再通過(guò)非變性梯度凝膠電泳對(duì)洗脫后的14-3-3zeta蛋白進(jìn)一步純化和除鹽。對(duì)含有目標(biāo)蛋白的凝膠進(jìn)行切割處理。冷凍干燥后碾成粉末，作為重組蛋白抗原。 (3)14-3-3zeta蛋白多克隆抗體的制備：分別利用14-3-3zeta蛋白C端合成多肽以及14-3-3zeta重組蛋白作為抗原，對(duì)純種新西蘭兔進(jìn)行免疫，獲得了兔抗人14-3-3zeta蛋白的抗血清。用誘導(dǎo)后的BL21／pDEST17-14-3-3zeta對(duì)兩種抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。Western blot測(cè)定表明兔抗14-3-3zeta蛋白抗體的效價(jià)為1：500，而兔抗14-3-3zeta多肽抗體的效價(jià)為1：400。 (4)14-3-3zeta抗體的特異性檢測(cè)：現(xiàn)有構(gòu)建好的質(zhì)粒pDEST17-14-3-3-beta、pDEST17-14-3-3-gamma、pDEST17-14-3-3-epsilon、pDEST17-14-3-3-eta、pDEST17-14-3-3-zeta、pDEST17-14-3-3-tau和pDEST17-14-3-3-sigmmar，經(jīng)BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后，分別用商品化的兔抗His抗體、自制的兔抗zeta蛋白抗體及自制的兔抗zeta蛋白C端多肽抗體標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兔抗zeta蛋白C端多肽抗體具有特異性，僅識(shí)別zeta亞型；而兔抗zeta蛋白抗體可以結(jié)合zeta，tau，gamma三種亞型。 (5)抗14-3-3zeta多肽抗體的免疫細(xì)胞分析：分別將真核表達(dá)空質(zhì)粒pcDNA3和重組質(zhì)粒pDEST26-14-3-3zeta轉(zhuǎn)化到哺乳動(dòng)物細(xì)胞cos7，通過(guò)自制的抗14-3-3zeta蛋白C端多肽抗體標(biāo)記轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該抗體可以識(shí)別天然的14-3-3zeta蛋白，14-3-3zeta蛋白分布在cos7細(xì)胞質(zhì)的一側(cè)。 以上研究結(jié)果初步證明：抗14-3-3zeta多肽抗體具有特異性，僅結(jié)合14-3-3zeta亞型且能夠識(shí)別14-3-3zeta蛋白的天然構(gòu)象。以上的研究對(duì)14-3-3zeta蛋白的功能進(jìn)一步研究與腫瘤診斷提供了有利的工具。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2343843