【摘要】：目的：構(gòu)建含生殖支原體(Mycoplasma genitalium，Mg)p32基因的重組表達(dá)載體，在大腸埃希菌(E．coli)中誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物并研究其在Mg對HeLa細(xì)胞黏附過程中的作用，以便從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探索Mg對宿主細(xì)胞的黏附機(jī)制。 方法：相關(guān)軟件分析Mg的p32基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以Mg標(biāo)準(zhǔn)株G37為模板行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增p32全長843bp片段；經(jīng)雙酶切、連接反應(yīng)將p32克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a(+)／P32：連入的p32基因片段經(jīng)測序鑒定正確后，人工定點(diǎn)誘變該基因中的TGA密碼子為TGG；將誘變后測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E．coilBL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blotting分析和鑒定表達(dá)結(jié)果，Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，BCA法測定其濃度；將G37和純化的P32重組蛋白(rP32)分別免疫新西蘭兔，用所得相應(yīng)抗血清分別行黏附試驗(yàn)和黏附抑制試驗(yàn)。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增出約843bp的目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定表明其中插入的目的片段與GenBank上登錄的G37的p32基因序列完全一致。通過PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變，p32中的TGA被成功突變?yōu)門GG。SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組工程菌中表達(dá)了一相對分子量(M_r)約為37.6 KDa的目的蛋白，該目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在，，Western blotting檢測其能與G37免疫新西蘭兔所得血清發(fā)生特異性反應(yīng)。用
[Abstract]:Aim: to construct a recombinant expression vector containing the p32 gene of mycoplasma genitalium (Mycoplasma genitalium,Mg), induce expression in Escherichia coli (E.coli), purify the expression product and study its role in the process of Mg adhesion to HeLa cells. In order to further explore the adhesion mechanism of Mg to host cells at cellular and molecular level. Methods: the p32 gene sequence of Mg was analyzed and specific primers were designed. The p32 full-length 843bp fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using Mg standard strain G37 as template. After double enzyme digestion, ligation reaction, p32 was cloned into prokaryotic expression vector pET-30a (), to construct recombinant plasmid pET-30a () / P32: the p32 gene fragment was identified correctly by sequencing. The TGA codon of the gene was mutated to TGG; by artificial site-directed mutagenesis. The recombinant plasmid was transformed into E.coilBL21 (DE3) after mutagenesis. The expression was induced by IPTG. The expression results were analyzed and identified by SDS-PAGE and Western blotting. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and its concentration was determined by BCA. New Zealand rabbits were immunized with G37 and purified P32 recombinant protein (rP32) respectively. Adhesion test and adhesion inhibition test were performed with the corresponding antiserum. Results: the target fragment of about 843bp was amplified by PCR, and the recombinant plasmid was identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The result showed that the inserted target fragment was identical to the p32 gene sequence of G37 registered on GenBank. By site-directed mutagenesis mediated by PCR, the TGA in p32 was successfully mutated into TGG.SDS-PAGE. Under the induction of IPTG, a target protein of 37.6 KDa was expressed in the recombinant engineering strain. The target protein was detected by, Western blotting in the form of inclusion body, which could react specifically with the serum of New Zealand rabbits immunized with G37. With
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R375

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本文編號(hào)：2343804