【摘要】： 14-3-3zeta蛋白是14-3-3蛋白家族中的一個成員，通常以二聚體的形式存在。14-3-3蛋白是真核細胞中普遍存在的高度保守的蛋白家族，由7個亞型組成。14-3-3zeta蛋白能夠同時結(jié)合兩個配體，是信號傳導通路中的重要接頭蛋白。14-3-3zeta蛋白可以和受體、激酶等多種配體結(jié)合，通過相互作用調(diào)節(jié)它們的生物學活性。14-3-3蛋白是一種重要的抑制凋亡因子，近年來的研究表明14-3-3zeta與糖尿病腎病、抑郁癥、老年性癡呆病等多種疾病有關(guān)，但其相關(guān)機理仍未完全闡明。有關(guān)報道顯示14-3-3zeta蛋白在乳腺癌、肝癌中過量表達，可能成為腫瘤診斷中的一種新型潛在標記物 制備14-3-3zeta特異性抗體將為14-3-3zeta蛋白功能的深入研究和腫瘤診斷提供有利的工具。14-3-3蛋白家族高度保守，各亞型之間的同源性超過70％。目前所報道的14-3-3zeta抗體均未對14-3-3蛋白的7個亞型進行特異性鑒定，無法說明它的特異性。本論文旨在制備抗14-3-zeta蛋白的特異性抗體。為此，我們從以下幾個方面進行了研究。 (1)14-3-3zeta合成多肽抗原的制備：通過生物信息學14-3-3zeta蛋白氨基酸序列的同源性、疏水性、抗原決定簇等進行分析。通過對分析的結(jié)果進行處理，最終確定14-3-3zeta蛋白二序列位置為230-240的DTQGDEAEAG氨基酸序列為免疫肽段。該段多肽的特異性較大，親水性較強，但免疫原性一般。為增強該肽段的免疫原性，，將其鉸鏈在BSA上，獲得合成抗原。 (2)14-3-3zeta重組抗原的制備：以質(zhì)粒pDEST17為表達載體，在大腸桿菌中誘導表達14-3-3zeta基因融合蛋白的表達，通過His-鎳親和基質(zhì)純化14-3-3zeta蛋白。再通過非變性梯度凝膠電泳對洗脫后的14-3-3zeta蛋白進一步純化和除鹽。對含有目標蛋白的凝膠進行切割處理。冷凍干燥后碾成粉末，作為重組蛋白抗原。 (3)14-3-3zeta蛋白多克隆抗體的制備：分別利用14-3-3zeta蛋白C端合成多肽以及14-3-3zeta重組蛋白作為抗原，對純種新西蘭兔進行免疫，獲得了兔抗人14-3-3zeta蛋白的抗血清。用誘導后的BL21／pDEST17-14-3-3zeta對兩種抗血清進行效價測定。Western blot測定表明兔抗14-3-3zeta蛋白抗體的效價為1：500，而兔抗14-3-3zeta多肽抗體的效價為1：400。 (4)14-3-3zeta抗體的特異性檢測：現(xiàn)有構(gòu)建好的質(zhì)粒pDEST17-14-3-3-beta、pDEST17-14-3-3-gamma、pDEST17-14-3-3-epsilon、pDEST17-14-3-3-eta、pDEST17-14-3-3-zeta、pDEST17-14-3-3-tau和pDEST17-14-3-3-sigmmar，經(jīng)BL21(DE3)誘導表達后，分別用商品化的兔抗His抗體、自制的兔抗zeta蛋白抗體及自制的兔抗zeta蛋白C端多肽抗體標記。實驗結(jié)果表明兔抗zeta蛋白C端多肽抗體具有特異性，僅識別zeta亞型；而兔抗zeta蛋白抗體可以結(jié)合zeta，tau，gamma三種亞型。 (5)抗14-3-3zeta多肽抗體的免疫細胞分析：分別將真核表達空質(zhì)粒pcDNA3和重組質(zhì)粒pDEST26-14-3-3zeta轉(zhuǎn)化到哺乳動物細胞cos7，通過自制的抗14-3-3zeta蛋白C端多肽抗體標記轉(zhuǎn)染后的細胞，實驗結(jié)果表明該抗體可以識別天然的14-3-3zeta蛋白，14-3-3zeta蛋白分布在cos7細胞質(zhì)的一側(cè)。 以上研究結(jié)果初步證明：抗14-3-3zeta多肽抗體具有特異性，僅結(jié)合14-3-3zeta亞型且能夠識別14-3-3zeta蛋白的天然構(gòu)象。以上的研究對14-3-3zeta蛋白的功能進一步研究與腫瘤診斷提供了有利的工具。
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【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 智慧,柴寶峰,梁愛華,王偉;游仆蟲Rab家族成員Eorab1f基因的克隆、表達及多克隆抗體制備[J];動物學報;2005年02期

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5 唐娟;于娜;吳亮生;楊磊;仙玲玲;黃延紅;張樹軍;黃瑾;;人Neuritin在原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建及表達純化[J];中國生物工程雜志;2006年04期

6 何莉,朱旭東,毛志勇,朱恒奇,黃培堂;轉(zhuǎn)錄因子CTCF的克隆、表達及其抗體制備[J];生物技術(shù)通訊;2004年05期

7 尹娟;肖健;周志軍;朱華松;端義坤;;我國狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株糖蛋白氨基酸序列及其抗原位點分析[J];中國生物制品學雜志;2006年01期

8 于穎彥;計駿;潘玉申;劉炳亞;朱正綱;林言箴;;胃癌中IRX1基因的表達及生物信息學功能預測[J];外科理論與實踐;2006年06期

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2 肖冰;可溶性干細胞因子的原核表達和純化[D];四川大學;2005年

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4 高芳鑾;水稻瘤矮病毒P8、Pns10基因的原核表達及生物信息學分析[D];福建農(nóng)林大學;2006年

本文編號：2343844