【摘要】： 目的： 1．建立體外培養(yǎng)、擴增受體C3H小鼠骨髓源性樹突狀細胞(BM-DC)的方法，并對其進行鑒定；觀察其對供體C57BL／6小鼠可溶性抗原提呈的有效性。同時探討B(tài)7反義肽(B7 antisense peptide，B7AP)抑制單向混合淋巴細胞反應的作用，并明確B7AP顯著抑制單向混合淋巴細胞反應的最適工作濃度。 2．通過體外供體抗原間接識別反應體系，觀察B7AP預處理的負載供體抗原的受體樹突狀細胞(dendritic cell，DC)誘導針對供體抗原的特異性免疫低反應；同時通過體內實驗進一步觀察其可行性，并對其機制進行初步分析。 3．建立同種異基因小鼠頸總動脈原位移植模型(C57BL／6→C3H)，觀察阻斷間接識別途徑對移植動脈慢性排異的影響，并初步探討此種效應的局部機制。 方法： 1．體外分離受體C3H小鼠骨髓細胞，在重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(rmTNF-α)的刺激下，手法篩選、培養(yǎng)擴增受體小鼠骨髓源性樹突狀細胞；通過細胞形態(tài)、功能、表面分子表達對其進行鑒定。在培養(yǎng)過程中加入制備的供體C57BL／6小鼠可溶性抗原，通過與受體C3H小鼠脾臟T細胞進行單向混合淋巴細胞反應，觀察受體DC負載供體抗原的有效性。進一步利用不同濃度的B7AP與負載供體抗原的受體DC進行充分孵育，并與受體脾臟T細胞進行單向混合淋巴細胞反應(MLR)，建立B7AP濃度對數值與單向混合淋巴細胞反應cpm值(每分鐘液閃數)的曲線，應用統(tǒng)計學方法尋找B7AP顯著抑制單向混合淋巴細胞反應的最適工作濃度。 2．建立體外供體抗原間接識別反應體系，利用B7AP預處理的負載供體抗原的受體DC與受體T細胞行初次單向混合淋巴細胞反應，收集反應后受體T細胞，與負載供體抗原、第三供體抗原的受體DC和供體DC行再次單向混合淋巴細胞反應，觀察反應后受體T細胞針對間接途徑提呈的供體抗原、第三供體抗原以及直接途徑提呈的供體抗原的免疫活性。同時通過B7AP封閉的負載供體抗原的受體DC對受體小鼠進行預處理后，分離受體脾臟T細胞與負載供體抗原、第三供體抗原的受體DC和供體DC行再次單向混合淋巴細胞反應，了解B7AP封閉的負載供體抗原的受體DC體內有效性，并分別在早期和2月時對受體小鼠進行供體抗原刺激后取脾臟進行細胞因子和淋巴細胞凋亡(apoptosis)分析，初步探討免疫耐受的其他可能機制。 3．建立小鼠同種異基因頸總動脈原位移植模型(C57BL／6→C3H)，通過術前3天對受體小鼠進行股靜脈注射B7AP預處理的負載供體抗原的受體DC，2月后取移植動脈進行病理分析，觀察移植動脈內膜增生情況，作計算機圖像分析，并通過對移植動脈的免疫組化分析，初步了解此效應的局部機制。 結果： 1．在rmGM-CSF和TNF-α刺激下，可從受體C3H小鼠骨髓前體細胞培養(yǎng)擴增出大量的成熟DC。形態(tài)學符合成熟DC，表面高表達CD80、CD86、MHC-Ⅱ類抗原，功能上具有強烈的刺激不同品系小鼠T細胞增殖的能力。 2．在培養(yǎng)過程中加入供體抗原的受體DC具有顯著刺激受體T細胞增殖的能力。 3．B7AP預處理后的負載供體抗原的受體DC能夠有效減弱對受體T細胞的刺激增殖作用，并且在反義肽終濃度為10mg／L，或者與DC孵育時濃度為20mg／L時，能夠保證DC表面B7分子被完全封閉。 4．再次單向混合淋巴細胞反應結果顯示，B7AP預處理的負載供體抗原的受體DC能夠誘導產生針對供體抗原的免疫低反應，但仍然保持對第三抗原的免疫反應。 5．體內實驗也顯示B7AP封閉的負載供體抗原的受體DC對受體小鼠進行預處理后，，受體脾臟分離T細胞也能產生針對供體抗原的免疫低反應，同時受體在受到供體抗原刺激后脾臟細胞因子mRNA半定量RT-PCR結果顯示Th2分泌細胞因子IL-10明顯升高，而Th1分泌細胞因子IL-2、IFN-γ減弱，此種效應在一定時間內可以維持；但是受體脾臟淋巴細胞凋亡無改變。 6．體內外實驗均發(fā)現阻斷間接識別途徑形成的預處理受體T細胞仍能產生對直接途徑提呈的供體抗原的免疫反應。 7．成功建立同種異基因小鼠頸總動脈原位移植模型(C57BL／6→C3H)。 8．2月時取移植動脈，制作病理切片HE染色，觀察見預處理小鼠組移植動脈內膜增生不明顯，計算機圖像分析系統(tǒng)分析顯示預處理組小鼠移植動脈內膜相對厚度為0.071±0.034，而對照組的移植動脈相對內膜厚度為0.179±0.056，兩者差別具有統(tǒng)計學意義；同時移植動脈壁TGF-β1免疫組化分析顯示預處理組TGF-β1的表達相對于對照組明顯減弱，與動脈內膜增生程度一致。 結論 1．C3H小鼠骨髓前體細胞在rmGM-CSF和TNF-α的刺激下，可以擴增培養(yǎng)大量成熟DC。 2．受體C3H小鼠的成熟DC能夠有效的提呈供體C57BL／6小鼠可溶性抗原。 3．負載供體抗原的受體C3H小鼠DC經B7AP預處理后能夠抑制其和受體小鼠T細胞的單向混合淋巴細胞反應。 4．B7AP預處理的負載供體抗原的受體DC能夠誘導針對供體抗原的特異性免疫低反應，同時可能通過誘導Th1→Th2免疫偏移來加強這種效應。 5．阻斷間接途徑產生的受體T細胞的特異性免疫低反應不影響其對直接途徑提呈的供體抗原的免疫反應。 6．B7AP預處理的負載供體抗原的受體DC能夠有效抑制小鼠同種異基因頸總動脈原位移植(C57BL／6→C3H)后移植動脈的內膜增生，TGF-β1在局部可能發(fā)揮一定的作用。 7．B7AP阻斷間接識別途徑能夠有效抑制同種異體移植慢性排異反應。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392.4

【參考文獻】

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本文編號：2342393