【摘要】： 【研究背景及目的】 Src抑制的蛋白激酶C的底物(Src Suppressed C Kinase Substrates，SSeCKS)是1995年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞支架蛋白，屬于蛋白激酶A錨定蛋白超家族(A Kinase Anchoring Protein，AKAP)中的成員。SSeCKS的分子量為280／290kD，其氨基端有膜定位序列和蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)結(jié)合位點(diǎn)，羧基端有蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)結(jié)合位點(diǎn)。SSeCKS廣泛表達(dá)于平滑肌細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管的內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cell，EC)等。對SSeCKS功能研究發(fā)現(xiàn)：SSeCKS通過錨定細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)控制G1／S期進(jìn)程而調(diào)節(jié)有絲分裂；通過錨定PKC而參與肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。對SSeCKS分子表達(dá)與疾病相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)毒素血癥模型中脾臟、肝臟、淋巴結(jié)的EC中SSeCKS表達(dá)上調(diào)。 為進(jìn)一步明確EC中SSeCKS所參與的生物學(xué)功能，及炎癥刺激EC SSeCKS表達(dá)上調(diào)的意義，本課題首先研究了SSeCKS與EC增殖、粘附和遷移的關(guān)系；其次研究了SSeCKS與炎癥的相關(guān)性；最后研究了SSeCKS與炎癥刺激EC骨架結(jié)構(gòu)改變的關(guān)系。 本研究在初步分析SSeCKS參與EC有關(guān)功能的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)SSeCKS參與炎癥刺激后EC骨架結(jié)構(gòu)的改變，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本課題的開展可能為臨床上認(rèn)識膿毒血癥等炎癥引起血管通透性增加的機(jī)理及治療提供新的思路。 【方法】 (1)用纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)包被六孔板，通過免疫印跡(Western blotting)檢測SSeCKS在EC黏附過程中的表達(dá)情況，免疫熒光法檢測SSeCKS在EC遷移過程中的定位情況，流式細(xì)胞儀分析EC細(xì)胞周期，并檢測相應(yīng)細(xì)胞周期中SSeCKS的表達(dá)情況。 (2)應(yīng)用BALB／c小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立內(nèi)毒素血癥模型，分別在1mg／kg、5mg／kg、10mg／kg、15mg／kg LPS腹腔注射后8h處死小鼠取肺組織，或在5mg／kg LPS腹腔注射后0、1、3、8、12、24h處死小鼠取肺組織。蘇木素伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變情況；實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time-PCR)檢測肺組織SSeCKS在mRNA水平的表達(dá)；原位雜交檢測SSeCKS mRNA在肺組織中的定位情況；Western blotting檢測肺組織SSeCKS在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化；免疫熒光雙標(biāo)法觀察肺組織SSeCKS的細(xì)胞定位。 (3)分別應(yīng)用LPS、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)刺激大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Rat Pulmonary Microvessel Endothelial Cell，RPMVEC)及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304，并根據(jù)刺激時(shí)間和刺激劑量的不同分批收集細(xì)胞。Real time-PCR法檢測SSeCKS mRNA水平的表達(dá)情況；原位雜交法檢測SSeCKS mRNA在細(xì)胞中的定位；Western blotting檢測SSeCKS蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化；免疫熒光法檢測SSeCKS在細(xì)胞中的定位情況和F-actin的改變情況。構(gòu)建SSeCKS siRNA干擾質(zhì)粒，并應(yīng)用SSeCKS siRNA干擾質(zhì)粒封閉內(nèi)源性SSeCKS的表達(dá)；Western blotting檢測SSeCKS siRNA對ERK信號通路的影響；免疫熒光檢測SSeCKS siRNA對細(xì)胞骨架的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(?)±s表示，用STAT 8．0軟件進(jìn)行One-Way-ANOVA分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(S-N-K)檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)果】 (1)FN能夠顯著誘導(dǎo)EC粘附和遷移，SSeCKS的表達(dá)量也隨之增加，具有時(shí)間和劑量依賴性關(guān)系，且SSeCKS在細(xì)胞層狀偽足聚集；經(jīng)PKC抑制劑(Ro31-8220、Calphostin C)處理細(xì)胞后，細(xì)胞黏附率和遷移細(xì)胞數(shù)較處理前顯著減少，SSeCKS在細(xì)胞內(nèi)散在分布，且纖維肌動(dòng)蛋白(Filament actin，F(xiàn)-actin)骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生重組，SSeCKS在內(nèi)皮細(xì)胞增殖后期表達(dá)增加。 (2)SSeCKS的表達(dá)水平與LPS用量呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴關(guān)系：在1、5、10和15mg／kg組SSeCKS mRNA水平的表達(dá)量皆顯著高于對照組(P＜0.05)，且隨LPS注射劑量增高，SSeCKS mRNA表達(dá)量亦逐漸增高；而不同時(shí)相中，LPS(5mg／kg)注射后肺組織中SSeCKS mRNA水平表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化過程，1h開始增高，3h達(dá)到表達(dá)高峰，12h降至正常水平；SSeCKS蛋白水平表達(dá)變化與mRNA水平變化相一致。SSeCKS在肺組織中定位于肺泡間隔毛細(xì)血管EC。 (3)LPS、TNF-α、IL-1β以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)EC中SSeCKS表達(dá)增加；經(jīng)LPS、TNF-α和IL-1β刺激后，F(xiàn)-actin發(fā)生重構(gòu)，SSeCKS向核周、細(xì)胞膜纖維狀、板狀偽足聚集；PKC抑制劑Calphostin C可抑制LPS、TNF-α和IL-1β對內(nèi)皮細(xì)胞F-actin和SSeCKS細(xì)胞內(nèi)定位改變的影響。細(xì)胞免疫熒光和Western blotting檢測顯示SSeCKS siRNA能夠顯著下調(diào)SSeCKS蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05)，引起一系列變化：EC骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維增粗增多；LPS、TNF-α和IL-1β刺激EC引起的骨架結(jié)構(gòu)改變受到抑制；LPS、TNF-α和IL-1β刺激EC后ERK磷酸化受到抑制。 【結(jié)論】 (1)SSeCKS在EC粘附、遷移過程中的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)生改變，提示了SSeCKS可能通過細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變，在EC粘附、遷移過程中發(fā)揮重要作用。SSeCKS在內(nèi)皮細(xì)胞增殖后期表達(dá)增加提示SSeCKS可能參與內(nèi)皮細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控。 (2)內(nèi)毒素以時(shí)間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)肺組織SSeCKS表達(dá)上調(diào)，，提示SSeCKS作為PKC的底物，在PKC信號途徑參加炎癥反應(yīng)中，可能具有一定的意義。 (3)LPS、TNF-α和IL-1β能誘導(dǎo)EC中F-actin重構(gòu)及SSeCKS表達(dá)和亞定位發(fā)生改變；抑制PKC活性和封閉內(nèi)源性SSeCKS表達(dá)均可阻斷LPS、TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)的EC骨架結(jié)構(gòu)改變，并使ERK的磷酸化水平增高受抑制。這提示SSeCKS可能通過與PKC結(jié)合，參與炎癥刺激EC骨架結(jié)構(gòu)改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2319954