【摘要】： 目的: IgE介導(dǎo)性疾病是一類由IgE引發(fā)的變態(tài)反應(yīng)性疾病的統(tǒng)稱,因其易感者在接觸環(huán)境中變應(yīng)原時(shí)往往產(chǎn)生過多的IgE抗體,通常伴有一種以上的變態(tài)反應(yīng)性疾病而得名。當(dāng)變應(yīng)原初次進(jìn)入機(jī)體后,選擇性誘導(dǎo)特異性B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體應(yīng)答,而血清中游離的IgE可在不結(jié)合抗原的情況下通過其Fc片段與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面受體結(jié)合使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。機(jī)體再次接觸變應(yīng)原后,多價(jià)變應(yīng)原與致敏細(xì)胞表面兩個(gè)或者兩個(gè)以上相鄰的IgE抗體結(jié)合,使細(xì)胞膜表面受體發(fā)生交聯(lián),觸發(fā)致敏細(xì)胞脫顆粒,合成及釋放生物活性介質(zhì),從而引起局部或者全身過敏反應(yīng)。IgE介導(dǎo)性疾病通常包括特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)、變應(yīng)性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)、支氣管哮喘(Asthma,AS)等,癥狀重者可導(dǎo)致過敏性休克,危及生命。變態(tài)反應(yīng)性疾病已嚴(yán)重干擾了患者的工作和生活,由此帶來的社會(huì)負(fù)擔(dān)也是相當(dāng)可觀的。由于IgE在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)中的重要作用,目前已經(jīng)成為抗變態(tài)反應(yīng)性疾病治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。IgE的分子結(jié)構(gòu)已清楚,在人IgE抗體中與氋親和力受體和低親和力受體結(jié)合的位點(diǎn)重點(diǎn)位于Cε3結(jié)構(gòu)域,雖然針對(duì)此區(qū)域的單克隆抗體已經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市并在臨床應(yīng)用中顯示出了良好的效果,但是,造價(jià)的昂貴和使用上的不便限制了其廣泛應(yīng)用,因此,由被動(dòng)地接受這種抗體蛋白轉(zhuǎn)向?qū)で筢槍?duì)該蛋白的主動(dòng)免疫疫苗有著更好的應(yīng)用前景。本課題擬構(gòu)建能夠誘導(dǎo)出針對(duì)IgE受體結(jié)合位點(diǎn)(Cε3結(jié)構(gòu)域)特異性中和抗體的治療性疫苗,通過抗原抗體結(jié)合產(chǎn)生的原子空間排列效應(yīng)或誘導(dǎo)的構(gòu)像改變來封閉IgE Fc片段上與IgE Fc受體結(jié)合的部位,進(jìn)而阻斷由IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病效應(yīng)途徑,為IgE介導(dǎo)性疾病的治療提供新的途徑。方法:我們利用全基因組PCR的方法擴(kuò)增出小鼠IgE受體結(jié)合位點(diǎn)(Cε3結(jié)構(gòu)域)的基因片斷,并構(gòu)建了針對(duì)此區(qū)域的基因疫苗和蛋白疫苗;運(yùn)用多種B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)法分析并篩選出Cε3區(qū)域的表位以構(gòu)建多肽疫苗。為了打破疫苗的免疫耐受和加強(qiáng)疫苗免疫原性,我們?cè)跇?gòu)建IgE受體結(jié)合位點(diǎn)蛋白疫苗和基因疫苗時(shí)在其N-端插入了來源于破傷風(fēng)毒素的具有激活Th細(xì)胞作用的通用Th細(xì)胞表位TT830-844;構(gòu)建多肽疫苗時(shí),人工合成該線形表位肽所對(duì)應(yīng)的四分支多聚抗原肽(Multiple Antigenic Peptide,MAP)以增強(qiáng)免疫效果。將小鼠隨機(jī)分為健康組(H)、哮喘組(A)、空載體組(pVAC-cms)、基因疫苗組(pVAC-CH3-TT)、蛋白疫苗組(pQE30-CH3-TT)、多聚抗原肽組(MAP)進(jìn)行免疫,ELISA法檢測(cè)各組血清抗體滴度。免疫完畢,除健康組外其余五組均采用卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)制造小鼠哮喘模型,通過對(duì)血清抗體滴度、哮喘系列指標(biāo)的測(cè)定以及肺組織病理切片的鑒定綜合評(píng)估幾種疫苗對(duì)哮喘的抑制效果。 結(jié)果:基因疫苗構(gòu)建結(jié)果顯示,融合了TT表位的CH3基因片斷與質(zhì)粒pVAC-cms重組后,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR、Western-Blot鑒定CH3-TT重組蛋白在CHO細(xì)胞中明顯表達(dá);純化后,OD260/280比值和電泳結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pVAC-CH3-TT基因疫苗符合免疫動(dòng)物的質(zhì)量要求。蛋白疫苗構(gòu)建結(jié)果顯示,我們?cè)诖竽c桿菌中成功地克隆、表達(dá)了CH3-TT融合蛋白,該蛋白以包涵體形式表達(dá)。運(yùn)用多種B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)法并結(jié)合以往文獻(xiàn)篩選出一條Cε3區(qū)域的表位肽并化學(xué)合成該線形肽對(duì)應(yīng)的四分支MAP。三種候選疫苗在小鼠身上進(jìn)行了免疫試驗(yàn),經(jīng)ELISA法檢測(cè)均可誘導(dǎo)出特異性的IgE受體結(jié)合位點(diǎn)中和抗體,其中MAP組的抗體滴度約為1:6400,基因疫苗和蛋白疫苗組的抗體滴度約為1:3200。在OVA所致的哮喘模型中,肺組織病理切片可見支氣管周圍、血管周圍的炎癥細(xì)胞尤其是嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),杯狀細(xì)胞增生,上皮下纖維化、膠原增生等癥狀,肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Fluid,BALF)中的炎癥細(xì)胞明顯增多,而在健康對(duì)照組則未見以上現(xiàn)象;小鼠哮喘模型之前給予疫苗免疫者,肺內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減少,上皮結(jié)構(gòu)基本正常,其中基因疫苗組pVAC-CH3-TT BALF中嗜酸粒細(xì)胞占(1.9±1.8)%,蛋白疫苗組pQE30-CH3-TT為(4.2±1.8)%,多聚抗原肽組MAP為(4.0±2.8)%,均顯著低于哮喘模型組(12.3±2.1)%和空載體組(11.8±5.7)%(P0.01),另外pVAC-CH3-TT組嗜酸性粒細(xì)胞比率低于pQE30-CH3-TT組和MAP組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);在小鼠造模前進(jìn)行疫苗免疫可明顯抑制肺內(nèi)IL-4濃度和血清中IgE含量,與哮喘組肺內(nèi)IL-4濃度(50.30±18.76)pg/mL相比,pVAC-CH3-TT組、pQE30-CH3-TT組、MAP組肺內(nèi)IL-4濃度明顯降低,分別為(14.02±9.36)pg/mL,(20.88±13.48)pg/mL,(18.14±13.19)pg/mL(P0.05);血清IgE含量的OD值測(cè)定中,pVAC-CH3-TT組的OD值為(0.10±0.02),pQE30-CH3-TT組為(0.21±0.03),MAP組為(0.18±0.05),均較哮喘組(0.47±0.03)有顯著降低(P0.01),其中pVAC-CH3-TT組的血清IgE含量的OD值要顯著低于其他兩個(gè)疫苗組(P0.05)。三個(gè)疫苗組能顯著抑制腸系膜上肥大細(xì)胞脫顆粒(P0.05),但其脫顆粒百分率仍與健康小鼠有差異(P0.05)。各疫苗組對(duì)小鼠耳廓腫脹程度、小鼠體重以及肺濕重?zé)o顯著影響(P0.05)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了針對(duì)小鼠IgE受體結(jié)合位點(diǎn)的基因疫苗、蛋白疫苗和多聚抗原肽疫苗。用適當(dāng)劑量的三種IgE受體結(jié)合位點(diǎn)疫苗免疫小鼠可明顯抑制哮喘小鼠血清中IgE的含量,過敏原所致的肺內(nèi)炎癥指標(biāo)有所減輕,對(duì)腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象有一定程度的抑制。三種疫苗動(dòng)物免疫結(jié)果分析表明,基因疫苗免疫效果略好于多聚抗原肽疫苗和蛋白疫苗疫苗,為進(jìn)一步利用與IgE分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的主動(dòng)免疫策略治療過敏性哮喘探索了新的途徑。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 譚夢(mèng)暉;李秀芳;金若敏;姚廣濤;符勝光;譚森文;;3種品系大鼠對(duì)燈盞花素所致被動(dòng)皮膚過敏差異性研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2011年09期

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本文編號(hào)：2320456