【摘要】： 目的: IgE介導(dǎo)性疾病是一類由IgE引發(fā)的變態(tài)反應(yīng)性疾病的統(tǒng)稱,因其易感者在接觸環(huán)境中變應(yīng)原時往往產(chǎn)生過多的IgE抗體,通常伴有一種以上的變態(tài)反應(yīng)性疾病而得名。當變應(yīng)原初次進入機體后,選擇性誘導(dǎo)特異性B細胞產(chǎn)生IgE抗體應(yīng)答,而血清中游離的IgE可在不結(jié)合抗原的情況下通過其Fc片段與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面受體結(jié)合使機體處于致敏狀態(tài)。機體再次接觸變應(yīng)原后,多價變應(yīng)原與致敏細胞表面兩個或者兩個以上相鄰的IgE抗體結(jié)合,使細胞膜表面受體發(fā)生交聯(lián),觸發(fā)致敏細胞脫顆粒,合成及釋放生物活性介質(zhì),從而引起局部或者全身過敏反應(yīng)。IgE介導(dǎo)性疾病通常包括特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)、變應(yīng)性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)、支氣管哮喘(Asthma,AS)等,癥狀重者可導(dǎo)致過敏性休克,危及生命。變態(tài)反應(yīng)性疾病已嚴重干擾了患者的工作和生活,由此帶來的社會負擔(dān)也是相當可觀的。由于IgE在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)中的重要作用,目前已經(jīng)成為抗變態(tài)反應(yīng)性疾病治療的一個新的靶點和研究熱點。IgE的分子結(jié)構(gòu)已清楚,在人IgE抗體中與氋親和力受體和低親和力受體結(jié)合的位點重點位于Cε3結(jié)構(gòu)域,雖然針對此區(qū)域的單克隆抗體已經(jīng)FDA批準上市并在臨床應(yīng)用中顯示出了良好的效果,但是,造價的昂貴和使用上的不便限制了其廣泛應(yīng)用,因此,由被動地接受這種抗體蛋白轉(zhuǎn)向?qū)で筢槍υ摰鞍椎闹鲃用庖咭呙缬兄玫膽?yīng)用前景。本課題擬構(gòu)建能夠誘導(dǎo)出針對IgE受體結(jié)合位點(Cε3結(jié)構(gòu)域)特異性中和抗體的治療性疫苗,通過抗原抗體結(jié)合產(chǎn)生的原子空間排列效應(yīng)或誘導(dǎo)的構(gòu)像改變來封閉IgE Fc片段上與IgE Fc受體結(jié)合的部位,進而阻斷由IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病效應(yīng)途徑,為IgE介導(dǎo)性疾病的治療提供新的途徑。方法:我們利用全基因組PCR的方法擴增出小鼠IgE受體結(jié)合位點(Cε3結(jié)構(gòu)域)的基因片斷,并構(gòu)建了針對此區(qū)域的基因疫苗和蛋白疫苗;運用多種B細胞表位預(yù)測法分析并篩選出Cε3區(qū)域的表位以構(gòu)建多肽疫苗。為了打破疫苗的免疫耐受和加強疫苗免疫原性,我們在構(gòu)建IgE受體結(jié)合位點蛋白疫苗和基因疫苗時在其N-端插入了來源于破傷風(fēng)毒素的具有激活Th細胞作用的通用Th細胞表位TT830-844;構(gòu)建多肽疫苗時,人工合成該線形表位肽所對應(yīng)的四分支多聚抗原肽(Multiple Antigenic Peptide,MAP)以增強免疫效果。將小鼠隨機分為健康組(H)、哮喘組(A)、空載體組(pVAC-cms)、基因疫苗組(pVAC-CH3-TT)、蛋白疫苗組(pQE30-CH3-TT)、多聚抗原肽組(MAP)進行免疫,ELISA法檢測各組血清抗體滴度。免疫完畢,除健康組外其余五組均采用卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)制造小鼠哮喘模型,通過對血清抗體滴度、哮喘系列指標的測定以及肺組織病理切片的鑒定綜合評估幾種疫苗對哮喘的抑制效果。 結(jié)果:基因疫苗構(gòu)建結(jié)果顯示,融合了TT表位的CH3基因片斷與質(zhì)粒pVAC-cms重組后,瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞,經(jīng)RT-PCR、Western-Blot鑒定CH3-TT重組蛋白在CHO細胞中明顯表達;純化后,OD260/280比值和電泳結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pVAC-CH3-TT基因疫苗符合免疫動物的質(zhì)量要求。蛋白疫苗構(gòu)建結(jié)果顯示,我們在大腸桿菌中成功地克隆、表達了CH3-TT融合蛋白,該蛋白以包涵體形式表達。運用多種B細胞表位預(yù)測法并結(jié)合以往文獻篩選出一條Cε3區(qū)域的表位肽并化學(xué)合成該線形肽對應(yīng)的四分支MAP。三種候選疫苗在小鼠身上進行了免疫試驗,經(jīng)ELISA法檢測均可誘導(dǎo)出特異性的IgE受體結(jié)合位點中和抗體,其中MAP組的抗體滴度約為1:6400,基因疫苗和蛋白疫苗組的抗體滴度約為1:3200。在OVA所致的哮喘模型中,肺組織病理切片可見支氣管周圍、血管周圍的炎癥細胞尤其是嗜酸性粒細胞浸潤,杯狀細胞增生,上皮下纖維化、膠原增生等癥狀,肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Fluid,BALF)中的炎癥細胞明顯增多,而在健康對照組則未見以上現(xiàn)象;小鼠哮喘模型之前給予疫苗免疫者,肺內(nèi)嗜酸性粒細胞浸潤程度明顯減少,上皮結(jié)構(gòu)基本正常,其中基因疫苗組pVAC-CH3-TT BALF中嗜酸粒細胞占(1.9±1.8)%,蛋白疫苗組pQE30-CH3-TT為(4.2±1.8)%,多聚抗原肽組MAP為(4.0±2.8)%,均顯著低于哮喘模型組(12.3±2.1)%和空載體組(11.8±5.7)%(P0.01),另外pVAC-CH3-TT組嗜酸性粒細胞比率低于pQE30-CH3-TT組和MAP組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);在小鼠造模前進行疫苗免疫可明顯抑制肺內(nèi)IL-4濃度和血清中IgE含量,與哮喘組肺內(nèi)IL-4濃度(50.30±18.76)pg/mL相比,pVAC-CH3-TT組、pQE30-CH3-TT組、MAP組肺內(nèi)IL-4濃度明顯降低,分別為(14.02±9.36)pg/mL,(20.88±13.48)pg/mL,(18.14±13.19)pg/mL(P0.05);血清IgE含量的OD值測定中,pVAC-CH3-TT組的OD值為(0.10±0.02),pQE30-CH3-TT組為(0.21±0.03),MAP組為(0.18±0.05),均較哮喘組(0.47±0.03)有顯著降低(P0.01),其中pVAC-CH3-TT組的血清IgE含量的OD值要顯著低于其他兩個疫苗組(P0.05)。三個疫苗組能顯著抑制腸系膜上肥大細胞脫顆粒(P0.05),但其脫顆粒百分率仍與健康小鼠有差異(P0.05)。各疫苗組對小鼠耳廓腫脹程度、小鼠體重以及肺濕重?zé)o顯著影響(P0.05)。 結(jié)論:本實驗分別構(gòu)建了針對小鼠IgE受體結(jié)合位點的基因疫苗、蛋白疫苗和多聚抗原肽疫苗。用適當劑量的三種IgE受體結(jié)合位點疫苗免疫小鼠可明顯抑制哮喘小鼠血清中IgE的含量,過敏原所致的肺內(nèi)炎癥指標有所減輕,對腹腔肥大細胞脫顆�，F(xiàn)象有一定程度的抑制。三種疫苗動物免疫結(jié)果分析表明,基因疫苗免疫效果略好于多聚抗原肽疫苗和蛋白疫苗疫苗,為進一步利用與IgE分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的主動免疫策略治療過敏性哮喘探索了新的途徑。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【引證文獻】

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1 譚夢暉;李秀芳;金若敏;姚廣濤;符勝光;譚森文;;3種品系大鼠對燈盞花素所致被動皮膚過敏差異性研究[J];中國實驗方劑學(xué)雜志;2011年09期

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本文編號：2320456