發(fā)布時間：2018-11-02 10:11

【摘要】：【目的】探討人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-E mRNA在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中的表達(dá);建立熒光定量RT-PCR檢測腫瘤細(xì)胞OATP-E基因表達(dá)的方法并繪制出外標(biāo)準(zhǔn)曲線,為基礎(chǔ)研究、臨床治療和藥物篩選提供針對人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-E方面研究的有效手段。 【材料與方法】 1.細(xì)胞培養(yǎng):以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR,傳代待其生長穩(wěn)定后分別提取細(xì)胞總RNA待用。 2.細(xì)胞總RNA的提取:用Trizol試劑分別提取乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR的細(xì)胞總RNA。 3.RT-PCR反應(yīng):以所提取的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的細(xì)胞總RNA為原料,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得編碼人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-E的cDNA并進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。 4.構(gòu)建克隆載體pGEM-OATP-E標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒:提取并純化PCR產(chǎn)物,與pGEM-T Easy Vector質(zhì)粒載體相連接,構(gòu)建克隆載體pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細(xì)胞。 5.外標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:采用藍(lán)白斑染色方法篩選并提取pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒,并將該pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒定量后作為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制實(shí)時熒光定量RT-PCR方法檢測OATP-E mRNA的外標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6.采用本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法及其外標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測OATP-E mRNA在對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中的表
[Abstract]:[objective] to investigate the expression of OATP-E mRNA, a member of the human organic anion transport polypeptide superfamily, in breast cancer cell line MCF-7 and adriamycin resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR. To establish a fluorescence quantitative RT-PCR method for the detection of OATP-E gene expression in tumor cells and draw the standard curve for the study. Clinical treatment and drug screening provide an effective method for the study of OATP-E members of the human organic anion transporter polypeptide superfamily. [materials and methods] 1. Cell culture: breast cancer cell line MCF-7 and adriamycin resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR, were routinely cultured on RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum. The total cell RNA was extracted after stable growth. 2. Extraction of total cell RNA: total RNA. of breast cancer cell line MCF-7 and adriamycin resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR were extracted by Trizol reagent 3.RT-PCR reaction: the cDNA encoding human organic anion transporter polypeptide superfamily OATP-E was obtained by reverse transcription reaction from the total RNA of the extracted breast cancer cell line MCF-7 and was amplified by ordinary PCR. 4. The standard recombinant plasmid of clone vector pGEM-OATP-E was constructed. The PCR product was extracted and purified, and then ligated with pGEM-T Easy Vector plasmid vector. The recombinant plasmid of clone vector pGEM-OATP-E was constructed and transformed into Escherichia coli JM109 receptive cells. 5. The establishment of external standard curve: the recombinant plasmid of pGEM-OATP-E was screened and extracted by blue and white spot staining, and the recombinant plasmid of pGEM-OATP-E was used as standard after quantification. Draw real-time fluorescence quantitative RT-PCR method to detect the external standard curve of OATP-E mRNA. 6. Detection of OATP-E mRNA in adriamycin resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR by real-time fluorescent quantitative RT-PCR and its external standard curve established in this study
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R361.3

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本文編號：2305727