【摘要】： EnaC廣泛分布于腎臟、結腸、肺臟、大腦、卵巢、睪丸和胰腺等組織,其生理功能就是跨越緊密連接上皮單向轉運鈉離子。構成EnaC的亞基有α、β、γ和δ,其中α和δ直接參與通道空隙的形成,而α2βγ是廣泛分布的EnaC組成方式[4]。腎臟和結腸上皮細胞的EnaC接受鹽皮質激素的正向調節(jié),對于維持血鈉血鉀水平穩(wěn)定十分重要。通過對EnaC的調控,腎小管兩側液體的成分和體積就能夠維持穩(wěn)定。在呼吸道上皮組織,鈉離子通過EnaC吸收,氯離子則通過囊性纖維病跨膜傳導調節(jié)蛋白受體分泌。呼吸道表面鈉離子和氯離子反向運輸形成的滲透壓驅動力,決定了呼吸道表面液體容積。生理狀態(tài)下這兩種離子的運輸維持平衡,使呼吸道粘膜表面液體維持在適當厚度。這樣既可以保證粘膜纖毛清除率,又不至于讓滲出的液體堵塞呼吸道。 但是在大腦、卵巢、睪丸和胰腺組織,只檢測到ENaC-α和ENaC-δ亞基。這提示ENaC-α和ENaC-δ應該是以同源多聚體的形式分別表達于精子鞭毛中段和頂體。與α、β、γ構成的異聚體相比,這種離子通道具有不同的生理和藥理學特性。在大鼠和人精子上,ENaC-α亞基局限分布在鞭毛中段,它在小鼠精子上也有相同的分布特征;而膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)ENaC對小鼠精子獲能所需的超極化有抑制作用。綜合以上分析,ENaC-α亞基構成的ENaC很可能參與精子活力的調節(jié)。EnaC家族在精子發(fā)生和活力調控中所起的作用,目前所知甚少。加之精子形態(tài)結構的特殊性,相應的研究手段也受到很多限制。 因此,我們首先運用western-blot、免疫熒光檢測ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的表達和定位。初步的結果支持我們的猜測,即ENaC-α很可能參與精子活力的調控。為了證實這種推測,繼而使用計算機輔助精液分析檢測ENaC-α的阻斷劑EIPA(5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride hydrochloride)對精子活力的影響�；仡櫿麄�研究過程,我們在實驗中研究了上皮細胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸、精子上的表達及其與精子活力之間的關系,并初步探討ENaC-α在精子活力調控中的可能作用機制。 一、檢測ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的表達 本部分的主要實驗目的是研究上皮細胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上是否表達。 鑒定一種蛋白質分子是否存在于某種組織或細胞,最經典的方法就是蛋白質免疫印跡技術(western-blot)。從組織或培養(yǎng)細胞中提取的蛋白質樣品經過十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS PAGE)和轉膜,固定于硝酸纖維素膜。通過特異一抗和相應二抗(堿性磷酸酶或者過氧化物酶標記)的應用,目的蛋白分子被高度特異性地“辨識”。加入含有發(fā)光底物的溶液后,二抗上結合的辣根過氧化物酶作用于底物發(fā)出熒光使醫(yī)用膠片曝光,最終得到記錄有實驗結果的膠片。該實驗方法靈敏度非常高,不但可以鑒定蛋白有無和分子量大小,還可以半定量檢測目的蛋白在組織或培養(yǎng)細胞中的豐度。 本實驗的結果證實,上皮細胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上都有表達。其分子量約為75KD。 二、免疫熒光和免疫組化染色檢測ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的定位 通過上面實驗我們證實上皮細胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上都有表達。但是,它在睪丸中的表達分布特征是什么樣的?這需要進一步的研究。 為此,我們運用免疫組化染色技術分析其在睪丸的分布特征。試驗結果顯示,ENaC-α分布于大鼠睪丸的間質細胞、血管內皮細胞、支持細胞、Ap型精原細胞,精母細胞和精子細胞以及精子;在人睪丸中,其生精細胞系亦見明顯陽性表達。結果說明,在人和大鼠的睪丸中,ENaC-α都有表達,而且其分布具有共同特征。 后來運用免疫熒光技術再次分析其在大鼠睪丸的分布特征。試驗結果基本與組化染色一致,且在大鼠睪丸組織切片見精子鞭毛上有強陽性表達。不過相比之下,免疫熒光對胞漿中的目的蛋白顯示更清晰,而免疫組化染色似乎更易于辨識組織中各類細胞。 隨后運用免疫熒光技術分析其在大鼠和人精子分布特征。試驗結果顯示,ENaC-α分布于大鼠和人精子的鞭毛中段,這和前人在小鼠精子上的發(fā)現(xiàn)是一致的。 三、體外精子活力實驗觀測ENaC-α對大鼠和人精子活力的影響。 在大腦、卵巢、睪丸和胰腺組織,只檢測到ENaC-α和ENaC-δ亞基。這提示ENaC-α和ENaC-δ應該是以同源多聚體的形式分別表達于精子鞭毛中段和頂體。與α、β、γ構成的異聚體相比,這種離子通道具有不同的生理特性,但是仍對鹽酸阿米洛利及其衍生物敏感。在大鼠和人精子上,ENaC-α亞基局限分布在鞭毛中段,它在小鼠精子上也有相同的分布特征;而膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)ENaC對小鼠精子獲能所需的超極化有抑制作用�？赏改さ腸AMP擬似物或促獲能液體誘導精子獲能時,發(fā)現(xiàn)EnaC的功能被抑制了。綜合以上分析,ENaC-α亞基構成的ENaC很可能參與精子活力的調節(jié)。EnaC家族在精子發(fā)生和活力調控中所起的作用,目前所知甚少。加之精子形態(tài)結構的特殊性,相應的研究手段也受到很多限制。我們使用EnaC抑制劑EIPA,間接觀測EnaC活性對精子活力的影響。發(fā)現(xiàn)在獲能的孵育環(huán)境下,EnaC抑制劑EIPA可以促進精子的活力。無論正常人精子還是弱精子組,實驗組精子活力均高于對照組;在大鼠精子組也有同樣的發(fā)現(xiàn)。這個事實說明ENaC-α亞基構成的EnaC至少部分參與精子活力的調控。 四、總結 總結前人的發(fā)現(xiàn)和我們的實驗結果,認為ENaC-α與雄性生殖系統(tǒng)關系密切,可能對精子活力有調控作用。在這里,我們第一次提出EnaC抑制劑EIPA有促進精子活力的作用,并間接證明ENaC-α有抑制精子活力的趨勢。同時,我們從精子周圍環(huán)境pH變化的角度探討了ENaC-α抑制精子活力的可能機制。此外,針對ENaC-α有可能研制成為抗雄性生育藥品從而在男性避孕中發(fā)揮重要作用,以及作為一種診斷項目用于男性不育癥病因的查找和為人工輔助生殖技術提供優(yōu)質精子。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R698.2;R321.1

【引證文獻】

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1 崔梓豪;李青南;陸幸妍;;上皮鈉通道與疾病和藥物機制的研究進展[J];廣東醫(yī)學;2012年19期

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本文編號：2295991