【摘要】： EnaC廣泛分布于腎臟、結(jié)腸、肺臟、大腦、卵巢、睪丸和胰腺等組織,其生理功能就是跨越緊密連接上皮單向轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子。構(gòu)成EnaC的亞基有α、β、γ和δ,其中α和δ直接參與通道空隙的形成,而α2βγ是廣泛分布的EnaC組成方式[4]。腎臟和結(jié)腸上皮細(xì)胞的EnaC接受鹽皮質(zhì)激素的正向調(diào)節(jié),對(duì)于維持血鈉血鉀水平穩(wěn)定十分重要。通過(guò)對(duì)EnaC的調(diào)控,腎小管兩側(cè)液體的成分和體積就能夠維持穩(wěn)定。在呼吸道上皮組織,鈉離子通過(guò)EnaC吸收,氯離子則通過(guò)囊性纖維病跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白受體分泌。呼吸道表面鈉離子和氯離子反向運(yùn)輸形成的滲透壓驅(qū)動(dòng)力,決定了呼吸道表面液體容積。生理狀態(tài)下這兩種離子的運(yùn)輸維持平衡,使呼吸道粘膜表面液體維持在適當(dāng)厚度。這樣既可以保證粘膜纖毛清除率,又不至于讓滲出的液體堵塞呼吸道。 但是在大腦、卵巢、睪丸和胰腺組織,只檢測(cè)到ENaC-α和ENaC-δ亞基。這提示ENaC-α和ENaC-δ應(yīng)該是以同源多聚體的形式分別表達(dá)于精子鞭毛中段和頂體。與α、β、γ構(gòu)成的異聚體相比,這種離子通道具有不同的生理和藥理學(xué)特性。在大鼠和人精子上,ENaC-α亞基局限分布在鞭毛中段,它在小鼠精子上也有相同的分布特征;而膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ENaC對(duì)小鼠精子獲能所需的超極化有抑制作用。綜合以上分析,ENaC-α亞基構(gòu)成的ENaC很可能參與精子活力的調(diào)節(jié)。EnaC家族在精子發(fā)生和活力調(diào)控中所起的作用,目前所知甚少。加之精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的特殊性,相應(yīng)的研究手段也受到很多限制。 因此,我們首先運(yùn)用western-blot、免疫熒光檢測(cè)ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的表達(dá)和定位。初步的結(jié)果支持我們的猜測(cè),即ENaC-α很可能參與精子活力的調(diào)控。為了證實(shí)這種推測(cè),繼而使用計(jì)算機(jī)輔助精液分析檢測(cè)ENaC-α的阻斷劑EIPA(5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride hydrochloride)對(duì)精子活力的影響�；仡櫿麄�(gè)研究過(guò)程,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中研究了上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸、精子上的表達(dá)及其與精子活力之間的關(guān)系,并初步探討ENaC-α在精子活力調(diào)控中的可能作用機(jī)制。 一、檢測(cè)ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的表達(dá) 本部分的主要實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯可掀ぜ?xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上是否表達(dá)。 鑒定一種蛋白質(zhì)分子是否存在于某種組織或細(xì)胞,最經(jīng)典的方法就是蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(western-blot)。從組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS PAGE)和轉(zhuǎn)膜,固定于硝酸纖維素膜。通過(guò)特異一抗和相應(yīng)二抗(堿性磷酸酶或者過(guò)氧化物酶標(biāo)記)的應(yīng)用,目的蛋白分子被高度特異性地“辨識(shí)”。加入含有發(fā)光底物的溶液后,二抗上結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶作用于底物發(fā)出熒光使醫(yī)用膠片曝光,最終得到記錄有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的膠片。該實(shí)驗(yàn)方法靈敏度非常高,不但可以鑒定蛋白有無(wú)和分子量大小,還可以半定量檢測(cè)目的蛋白在組織或培養(yǎng)細(xì)胞中的豐度。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí),上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上都有表達(dá)。其分子量約為75KD。 二、免疫熒光和免疫組化染色檢測(cè)ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的定位 通過(guò)上面實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上都有表達(dá)。但是,它在睪丸中的表達(dá)分布特征是什么樣的?這需要進(jìn)一步的研究。 為此,我們運(yùn)用免疫組化染色技術(shù)分析其在睪丸的分布特征。試驗(yàn)結(jié)果顯示,ENaC-α分布于大鼠睪丸的間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、支持細(xì)胞、Ap型精原細(xì)胞,精母細(xì)胞和精子細(xì)胞以及精子;在人睪丸中,其生精細(xì)胞系亦見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果說(shuō)明,在人和大鼠的睪丸中,ENaC-α都有表達(dá),而且其分布具有共同特征。 后來(lái)運(yùn)用免疫熒光技術(shù)再次分析其在大鼠睪丸的分布特征。試驗(yàn)結(jié)果基本與組化染色一致,且在大鼠睪丸組織切片見(jiàn)精子鞭毛上有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。不過(guò)相比之下,免疫熒光對(duì)胞漿中的目的蛋白顯示更清晰,而免疫組化染色似乎更易于辨識(shí)組織中各類(lèi)細(xì)胞。 隨后運(yùn)用免疫熒光技術(shù)分析其在大鼠和人精子分布特征。試驗(yàn)結(jié)果顯示,ENaC-α分布于大鼠和人精子的鞭毛中段,這和前人在小鼠精子上的發(fā)現(xiàn)是一致的。 三、體外精子活力實(shí)驗(yàn)觀測(cè)ENaC-α對(duì)大鼠和人精子活力的影響。 在大腦、卵巢、睪丸和胰腺組織,只檢測(cè)到ENaC-α和ENaC-δ亞基。這提示ENaC-α和ENaC-δ應(yīng)該是以同源多聚體的形式分別表達(dá)于精子鞭毛中段和頂體。與α、β、γ構(gòu)成的異聚體相比,這種離子通道具有不同的生理特性,但是仍對(duì)鹽酸阿米洛利及其衍生物敏感。在大鼠和人精子上,ENaC-α亞基局限分布在鞭毛中段,它在小鼠精子上也有相同的分布特征;而膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ENaC對(duì)小鼠精子獲能所需的超極化有抑制作用�？赏改さ腸AMP擬似物或促獲能液體誘導(dǎo)精子獲能時(shí),發(fā)現(xiàn)EnaC的功能被抑制了。綜合以上分析,ENaC-α亞基構(gòu)成的ENaC很可能參與精子活力的調(diào)節(jié)。EnaC家族在精子發(fā)生和活力調(diào)控中所起的作用,目前所知甚少。加之精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的特殊性,相應(yīng)的研究手段也受到很多限制。我們使用EnaC抑制劑EIPA,間接觀測(cè)EnaC活性對(duì)精子活力的影響。發(fā)現(xiàn)在獲能的孵育環(huán)境下,EnaC抑制劑EIPA可以促進(jìn)精子的活力。無(wú)論正常人精子還是弱精子組,實(shí)驗(yàn)組精子活力均高于對(duì)照組;在大鼠精子組也有同樣的發(fā)現(xiàn)。這個(gè)事實(shí)說(shuō)明ENaC-α亞基構(gòu)成的EnaC至少部分參與精子活力的調(diào)控。 四、總結(jié) 總結(jié)前人的發(fā)現(xiàn)和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為ENaC-α與雄性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切,可能對(duì)精子活力有調(diào)控作用。在這里,我們第一次提出EnaC抑制劑EIPA有促進(jìn)精子活力的作用,并間接證明ENaC-α有抑制精子活力的趨勢(shì)。同時(shí),我們從精子周?chē)h(huán)境pH變化的角度探討了ENaC-α抑制精子活力的可能機(jī)制。此外,針對(duì)ENaC-α有可能研制成為抗雄性生育藥品從而在男性避孕中發(fā)揮重要作用,以及作為一種診斷項(xiàng)目用于男性不育癥病因的查找和為人工輔助生殖技術(shù)提供優(yōu)質(zhì)精子。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R698.2;R321.1

【引證文獻(xiàn)】

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1 崔梓豪;李青南;陸幸妍;;上皮鈉通道與疾病和藥物機(jī)制的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2012年19期

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本文編號(hào)：2295991