【摘要】： 人類(lèi)的結(jié)腸具有吸收和分泌的重要機(jī)能,參與機(jī)體對(duì)水、電解質(zhì)平衡的調(diào)節(jié),維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。結(jié)腸的上皮細(xì)胞是致病因子與外環(huán)境作用于機(jī)體的主要靶細(xì)胞之一,也是機(jī)體許多病理變化的始發(fā)環(huán)節(jié)及主要病灶所在。衰老(aging)通常被定義為機(jī)體的正常生理功能隨著年齡的增長(zhǎng)而緩慢減退的過(guò)程,它是一種正常的、復(fù)雜的、不可逆的生物學(xué)過(guò)程,是機(jī)體的功能發(fā)生衰退及生理功能紊亂的綜合表現(xiàn)。結(jié)腸上皮同樣會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而出現(xiàn)生理功能逐漸減退,同時(shí)惡性腫瘤等多種腸道疾病的發(fā)病率明顯升高。針對(duì)結(jié)腸上皮的衰老機(jī)制,國(guó)內(nèi)外也已開(kāi)展了許多相關(guān)的研究:Lopes等人觀察到衰老大鼠的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞線(xiàn)粒體的形態(tài)和功能都發(fā)生了改變;Ono等人發(fā)現(xiàn),隨著年齡的增加,消化道上皮的DNA突變頻率增加,而以結(jié)腸的突變頻率最高;Tsurudome等發(fā)現(xiàn),在老年人的結(jié)腸癌組織中8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤(8-hydroxydeoxyguanosine)的水平升高,提示氧自由基對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞DNA的損傷程度增加。 以往的這些研究雖然揭示了一些結(jié)腸上皮衰老以及衰老結(jié)腸上皮對(duì)癌癥易感的機(jī)理,但是這些研究多數(shù)是從某個(gè)或某幾個(gè)基因出發(fā),而結(jié)腸上皮的衰老是一個(gè)漸進(jìn)的、多基因、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。另外,以往研究多集中在DNA和RNA水平,但由于基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的復(fù)雜性,DNA和RNA水平的變化并不能完全反映蛋白質(zhì)水平的變化,而蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行分子,并且蛋白質(zhì)的翻譯后修飾狀況、蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化等信息僅通過(guò)基因組研究是無(wú)法獲知的。傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)的研究方式和研究技術(shù)已無(wú)法滿(mǎn)足后基因組時(shí)代里對(duì)衰老這類(lèi)復(fù)雜生命現(xiàn)象的研究要求,而以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)則為衰老研究提供了新的研究思路和技術(shù)。差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容,與試圖了解細(xì)胞內(nèi)所有的表達(dá)蛋白質(zhì)—“表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)”不同的是,差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究更多的是關(guān)注于細(xì)胞在不同生理、病理狀態(tài)下的差異表達(dá)蛋白質(zhì),以期尋找或發(fā)現(xiàn)不同生理或病理狀態(tài)下的特征性蛋白質(zhì)。為此,本研究以青年人和老年人的正常結(jié)腸粘膜上皮組織為研究對(duì)象,采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法來(lái)研究人類(lèi)結(jié)腸上皮衰老相關(guān)的蛋白質(zhì),為闡明結(jié)腸上皮衰老的分子機(jī)制提供有意義的線(xiàn)索。 首先抽提制備青年組和老年組的結(jié)腸粘膜上皮組織的總蛋白質(zhì),再應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)建立了重復(fù)性和分辨率均較好的青年組和老年組結(jié)腸粘膜上皮組織總蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜。經(jīng)銀染顯色,ImageScanner掃描儀掃描凝膠,PDQuest圖像分析軟件對(duì)兩組的組織總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行了比較,識(shí)別兩組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)47個(gè),再聯(lián)合采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,獲取MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜及ESI-Q-TOF肽序列標(biāo)簽,再經(jīng)Mascot軟件搜索SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了其中的38個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。 為了驗(yàn)證比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果,采用Real-time quantitativeRT-PCR和Western blot分析以及免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)在青年組和老年組結(jié)腸粘膜上皮組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),其結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果一致。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證比較蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到的差異蛋白質(zhì)是否為真正的與衰老相關(guān)的差異蛋白質(zhì),本文采用D-半乳糖誘導(dǎo)方法建立NIH/3T3細(xì)胞復(fù)制性衰老模型,應(yīng)用Western blot檢測(cè)2個(gè)差異蛋白質(zhì)(EF-Tu、Rhodanese)在衰老NIH/3T3細(xì)胞中的表達(dá)變化,觀察到EF-Tu和Rhodanese在衰老NIH/3T3細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下調(diào),說(shuō)明EF-Tu和Rhodanese表達(dá)下調(diào)可能與體外細(xì)胞衰老有關(guān)。 本研究在建立青年組和老年組結(jié)腸粘膜上皮組織總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的基礎(chǔ)上,采用質(zhì)譜分析結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索共鑒定出38個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)按功能主要可以分為九類(lèi),即抗氧化蛋白質(zhì)、信號(hào)傳導(dǎo)類(lèi)蛋白質(zhì)、與凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)、分子伴侶、與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)蛋白質(zhì)、基本代謝相關(guān)的酶類(lèi)、轉(zhuǎn)錄與翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)、能量產(chǎn)生相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白。因此,本研究結(jié)果提示線(xiàn)粒體功能受損、抗氧化能力下降和細(xì)胞凋亡增加是結(jié)腸上皮衰老的主要原因,為闡明結(jié)腸上皮衰老的分子機(jī)制提供了有意義的新的線(xiàn)索。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 崔旭,李文彬,張炳烈,張潔,倪彬;D-半乳糖對(duì)神經(jīng)元和成纖維細(xì)胞擬老化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;1997年02期

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本文編號(hào)：2293488