【摘要】： 眾所周知，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷死亡率高，致殘率高。雖然近半個(gè)世紀(jì)以來，藥物治療和外科手術(shù)治療取得了很大進(jìn)展，但都僅是一種癥狀性治療，無法從根本上治療病變的神經(jīng)細(xì)胞。因此，探索一種新的有效的治療途徑，已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。 目前，在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療方法中，細(xì)胞移植已成為最有潛力的治療手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一種主要的成體干細(xì)胞，具有取材容易，有強(qiáng)大的增殖能力，在特定條件誘導(dǎo)下可以分化為三胚層組織細(xì)胞。近年來MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力倍受矚目。1998年，Aziz等把人的骨髓MSC直接注射至大鼠紋狀體，5～27 d后約20％的移植細(xì)胞存活并沿已知的神經(jīng)干細(xì)胞遷移的路徑遷移。Kopen(1999)等將骨髓MSCs注入新生小鼠側(cè)腦室，發(fā)現(xiàn)12天后MSCs遷往神經(jīng)元密集區(qū)域，在腦干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)微絲(neurofilament，NF)陽性細(xì)胞，表明MSCs可分化為神經(jīng)元；在紋狀體和海馬分子層MSCs表達(dá)了膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein，GFAP)，表明其也可分化為成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 應(yīng)用遺傳背景完全相同的MSCs進(jìn)行移植是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的最佳選擇，但是供體來源有限。于是嘗試不完全相合供、受體間干細(xì)胞的移植，已成為再生醫(yī)學(xué)未來發(fā)展的趨勢(shì)。 MSCs不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子和共刺激分子，不能刺激T細(xì)胞增殖。在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture，MLC)體系中，MSCs可以抑制同種異體的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。將體外擴(kuò)增的MSCs注射到狒狒體內(nèi)，同時(shí)對(duì)狒狒進(jìn)行同種異體皮膚移植，在不使用任何免疫抑制劑的情況下，該組皮膚排斥反應(yīng)推遲，皮片存活時(shí)間延長(zhǎng)(Bartholomew，2002)。同時(shí)接受同種異基因骨髓和MSCs移植患者的移植物抗宿主疾病(graft versus host disease，GVHD)的發(fā)生率明顯降低(Guo，2000；Kim，2006)。將MSCs向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后即不能表達(dá)MHC，也不能刺激T細(xì)胞增殖(Le Blanc，2003a；Liu，2006)，說明MSCs不但有多向分化潛能，而且免疫原性低，具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，是一種理想的組織工程細(xì)胞。 但是，近年來研究者們陸續(xù)提出不同的看法。將MSCs移植到同種異體的小鼠體內(nèi)，受體體內(nèi)的CD8+細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞增加，MSCs不能長(zhǎng)期存活(Eliopoulos，2005)。向移植受體體內(nèi)植入供體來源的MSCs后，MSCs與受體內(nèi)的記憶T細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，并激發(fā)宿主抗移植物反應(yīng)(Nauta，2006)。將MSCs誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞移植至紐西蘭白兔體內(nèi)，隨著移植時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的免疫抑制能力顯著下降(Liu，2006)。提示在活體內(nèi)MSCs仍可能激發(fā)免疫排斥反應(yīng)，并不能作為一種“萬能”的細(xì)胞在MHC不相容的個(gè)體間進(jìn)行移植。 長(zhǎng)期以來，研究者們認(rèn)為CNS是一個(gè)免疫赦免器官(Billingham，1953；Barker，1977)。但目前研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)并不是絕對(duì)的免疫赦免區(qū)。腦內(nèi)的赦免狀態(tài)只是免疫赦免與免疫效應(yīng)相互調(diào)節(jié)達(dá)到的動(dòng)態(tài)平衡(Brabb，2000；Bailey，2006；Engelhardt，2006；)。細(xì)胞腦內(nèi)移植后也可發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。目前，關(guān)于MSCs腦內(nèi)移植的研究主要集中于移植后腦功能的恢復(fù)及其機(jī)制探討。替代損傷的神經(jīng)元是移植MSCs改善腦功能的機(jī)制之一。移植至腦內(nèi)的同種異體MSCs以及其橫向分化的神經(jīng)元是否能逃避免疫排斥反應(yīng)，并且長(zhǎng)期存活呢?尚不清楚。 新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于圍產(chǎn)期各種因素導(dǎo)致的胎兒或新生兒缺氧、缺血引起腦組織損傷。盡管當(dāng)今圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)迅速發(fā)展，但HIBD仍是引起新生兒死亡、影響新生兒正常發(fā)育、導(dǎo)致兒童腦癱、精神發(fā)育遲滯、學(xué)習(xí)障礙和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因(Spong，2005)。目前臨床上缺少特異性的有效手段治療HIBD(韓玉昆，2000)。間充質(zhì)干細(xì)胞移植為臨床治療HIBD開辟了一條嶄新的途徑。但是，由于缺氧、缺血損傷導(dǎo)致腦組織彌漫性病變，腦內(nèi)的動(dòng)態(tài)免疫平衡遭到破壞，是否會(huì)誘發(fā)對(duì)植入細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)呢? 本試驗(yàn)旨在觀察骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的免疫學(xué)特性發(fā)育，以及HIBD模型小鼠腦內(nèi)移植后的免疫反應(yīng)，為骨髓MSCs移植治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)提供技術(shù)平臺(tái)。 試驗(yàn)分為以下三個(gè)部分： 一、骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中的免疫原性發(fā)育 目的：探討骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化后的移植免疫表型及其對(duì)同種異體T細(xì)胞增殖的作用。 方法：體外分離和培養(yǎng)人骨髓MSCs。用加入堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)的無血清培養(yǎng)基將MSCs誘導(dǎo)分化1周～2周；免疫熒光法和免疫印跡法進(jìn)行細(xì)胞性質(zhì)鑒定。將細(xì)胞分為未分化的MSCs組(MSCs組)、MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化1周的細(xì)胞組(Neu1組)和MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化2周的細(xì)胞組(Neu2組)。流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞免疫表型；各組細(xì)胞分別與同種異體的T細(xì)胞共培養(yǎng)，β液閃儀檢測(cè)T細(xì)胞增殖。比較γ-IFN100U／ml預(yù)處理48小時(shí)前后各組細(xì)胞的免疫表型和對(duì)T細(xì)胞的增殖作用。用spss11.0軟件包及Excel7.0分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：原代分離的骨髓為形態(tài)不均一的細(xì)胞。經(jīng)傳代4次后，細(xì)胞形態(tài)均一。對(duì)傳4代以上的細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果示陽性表達(dá)CD29，CD105，CD44；陰性表達(dá)CD34，CD14，CD45，說明培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，而不表達(dá)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志。將MSCs加入含bFGF、EGF的DMEM／F12(1：1)無血清培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。部分細(xì)胞5～7天后胞質(zhì)向胞核收縮，胞體變小，變成多角形和不規(guī)則形。14天后可見部分回縮的胞體延縱軸伸出長(zhǎng)長(zhǎng)的突起，交織成網(wǎng)狀。間接免疫熒光法檢測(cè)顯示，誘導(dǎo)前部分骨髓MSCs表達(dá)nestin，基本不表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuron specific enolase，NSE)、神經(jīng)微絲(neurofilament，NF—L)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)；誘導(dǎo)分化2周時(shí)，細(xì)胞表達(dá)nestin、NSE和NF—L顯著增加。GFAP在誘導(dǎo)分化2周的細(xì)胞中仍基本不表達(dá)。免疫印跡法檢測(cè)得到相似結(jié)果。以上結(jié)果表明MSCs主要向神經(jīng)元分化。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)前MSCs組表達(dá)HLA-Ⅰ類分子的經(jīng)典基因HLA-A，B，C，不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子的經(jīng)典基因HLA-DR和共刺激分子。誘導(dǎo)1周時(shí)和誘導(dǎo)2周時(shí)HLA-A，B，C、HLA-DR和共刺激分子CD80表達(dá)增加。各組間P＜0.05，有顯著性差異。然而，流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡檢測(cè)顯示誘導(dǎo)2周后CD40和CD86仍無表達(dá)。γ-IFN預(yù)處理后，MSCs組、Neu1組和Neu2組表達(dá)HLA-A，B，C和HLA-DR表達(dá)明顯增加。與未經(jīng)γ-IFN預(yù)處理的MSCs組、Neu1組和Neu2組相比，HLA分子的表達(dá)差異有顯著意義(P＜0.05)。但是，流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)均顯示，γ-IFN預(yù)處理前后共刺激分子CD40、CD80和CD86表達(dá)無明顯改變。各組細(xì)胞分別與同種異體T細(xì)胞共培養(yǎng)6天后，結(jié)果顯示MSCs抑制T細(xì)胞增殖，并且隨著MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，抑制作用明顯增強(qiáng)，各組間有顯著性差異，P＜0.05。 結(jié)論：骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞表達(dá)HLA分子和共刺激分子CD80增加，不能表達(dá)共刺激分子CD40和CD80，并且抑制T細(xì)胞增殖，提示細(xì)胞免疫原性低，有成熟的趨勢(shì)。 二、向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的骨髓MSCs對(duì)同種異體T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用 目的：探討骨髓MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化后對(duì)同種異體T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。 方法：骨髓MSCs原代分離、培養(yǎng)并向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞分組同第一部分。體外分離同種異體T細(xì)胞。向植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激同種異體T細(xì)胞增殖的培養(yǎng)體系中，加入MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的各組細(xì)胞，進(jìn)行共培養(yǎng)。比較γ-IFN100U／ml預(yù)處理48小時(shí)前后各組細(xì)胞對(duì)PHA刺激同種異體T細(xì)胞增殖的作用。采用transwell培養(yǎng)板分隔MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞和PHA刺激的同種異體T細(xì)胞培養(yǎng)體系。均用β液閃儀檢測(cè)T細(xì)胞增殖。 結(jié)果：與Con組比較，MSCs組、Neur1組和Neur2組細(xì)胞抑制PHA刺激的非特異性淋巴細(xì)胞增殖作用，各組間P＜0.05，有顯著性差異。隨著MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，體外試驗(yàn)中其抑制由PHA刺激的非特異性淋巴細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。γ-IFN預(yù)處理后，MSCs組、Neu1組和Neu2組細(xì)胞對(duì)非特異性淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。與未經(jīng)γ-IFN預(yù)處理的三組細(xì)胞分別進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，均為P＜0.05。與直接接觸培養(yǎng)的各組細(xì)胞比較，采用Transwell非接觸性培養(yǎng)對(duì)T細(xì)胞增殖無顯著影響(P＞0.05)。 結(jié)論：骨髓MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞抑制PHA刺激的T淋巴細(xì)胞增生；細(xì)胞分泌可溶性細(xì)胞因子是MSCs向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞抑制PHA刺激的T細(xì)胞增生的可能機(jī)制。 三、缺氧缺血腦損傷模型腦內(nèi)移植向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨髓MSCs的免疫排斥反應(yīng) 目的：探討向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨髓MSCs移植至HIBD模型腦內(nèi)后的免疫排斥反應(yīng)。 方法：7日齡新生昆明小鼠，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組(Con組)、HIBD模型組(HIBD組)、未分化MSCs移植組(MSCs組)、MSCs誘導(dǎo)分化1周細(xì)胞移植組(Neu1組)、MSCs誘導(dǎo)分化2周細(xì)胞移植組(Neu2組)。每組動(dòng)物12只。根據(jù)Ditelberg(1996)報(bào)道方法制作新生小鼠HIBD模型。各移植組小鼠10日齡時(shí)，給予腦內(nèi)移植1×10~5個(gè)細(xì)胞骨髓MSCs細(xì)胞懸液。采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦組織病理學(xué)分析觀察腦內(nèi)移植的療效。免疫熒光法檢測(cè)移植細(xì)胞HLA DR的表達(dá)和腦組織內(nèi)樹突狀細(xì)胞的標(biāo)志物CD11C和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Mac—1的表達(dá)。 結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，HIBD組在T迷宮強(qiáng)迫改變?cè)囼?yàn)、放射臂迷宮試驗(yàn)和足錯(cuò)誤試驗(yàn)中，表現(xiàn)明顯不足。MSCs組、Neu1組和Neu2組的各項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果較HIBD組均有明顯改善。MSCs組、Neu1組和Neu2組三組間無明顯差異。HIBD后4周，處死小鼠，并取腦。HIBD組、MSCs組、Neu1組、Neu2組可見左腦萎縮，Con組鼠腦未見明顯異常。小鼠腦組織切片HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，Con組皮層神經(jīng)元分布整齊，海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊；HIBD組可見大腦皮層神經(jīng)元丟失，海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列紊亂；MSCs組、Neu1組和Neu2組的神經(jīng)元損傷較HIBD組有明顯改善；MSCs組、Neu1組和Neu2組三組間的神經(jīng)元損傷無明顯差異。移植后1周，HLAⅡ類分子陽性率均低；移植后2周、4周，HLADR陽性率增高；與MSCs組比較，Neu2組HLA DR陽性率顯著增高。Con組基本不表達(dá)CD11C和Mac—1；HIBD組低水平表達(dá)CD11C和Mac—1；MSCs組、Neu1組和Neu2組均可見CD11C和Mac—1陽性細(xì)胞，其中Neu2組表達(dá)較明顯。 結(jié)論：腦內(nèi)移植MSCs及其向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可以改善HIBD模型小鼠的神經(jīng)功能損傷。移植MSCs與其向神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞移植比較，對(duì)HIBD模型的療效無明顯差異。MSCs及其向神經(jīng)分化細(xì)胞HIBD腦內(nèi)移植后，，移植細(xì)胞免疫原性增強(qiáng)，腦內(nèi)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，可誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)。 結(jié)論： 1．在體外，雖然骨髓MSCs免疫原性低，但是隨著其向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化，免疫原性呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)； 2．向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的骨髓MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用； 3．分泌可溶性細(xì)胞因子是向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的MSCs抑制PHA刺激的T細(xì)胞增生的可能機(jī)制之一； 4．腦內(nèi)移植向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的MSCs可以改善HIBD模型的神經(jīng)功能損傷，移植不同誘導(dǎo)分化程度的細(xì)胞對(duì)改善HIBD模型神經(jīng)功能損傷的作用無明顯不同； 5．HIBD腦內(nèi)移植MSCs及其向神經(jīng)分化的細(xì)胞后，移植細(xì)胞免疫原性增強(qiáng)，腦內(nèi)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，可能誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈延R

本文編號(hào)：2287836