【摘要】： 背景：妊娠目關(guān)血漿蛋白A(Pregnancy-associated Plasma Protein A，，PAPP-A)是一種與妊娠相關(guān)的大分子糖蛋白，主要是由胎盤合體滋養(yǎng)層和蛻膜產(chǎn)生。母體血清PAPP-A含量與妊娠周期密切相關(guān)，隨孕周的增加而持續(xù)上升，到妊娠末期達(dá)到高峰。PAPP-A是早孕階段母血中一個敏感特異的血清標(biāo)志物，孕早期母血中低水平的PAPP-A與后來發(fā)生的各種染色體異常、胎兒畸形、產(chǎn)科并發(fā)癥等異常妊娠有關(guān)。目前，在早孕階段測定孕婦血清中PAPP-A已經(jīng)應(yīng)用于臨床異常妊娠的預(yù)測，特別對于唐氏綜合征等染色體異常的篩查有較大的臨床價值。由于母血中低水平的PAPP-A與胎盤功能異常有關(guān)，因此PAPP-A是早孕階段預(yù)測異常妊娠的一個有價值的指標(biāo)。新近的研究表明PAPP-A是急性冠脈綜合征早期識別、進(jìn)行危險分層以及評價預(yù)后的一個新標(biāo)志物。 目的：從健康孕婦血清中分離純化PAPP-A蛋白，用所純化的抗原免疫小鼠，篩選分泌PAPP-A單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備抗人PAPP-A單克隆抗體，為建立PAPP-A檢測方法及其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 方法：利用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換和Heparin-Sepharose CL-6B親和層析從晚孕血清中分離純化PAPP-A，變性SDS-PAGE測定其相對分子質(zhì)量為200 kDa，western blotting鑒定其特異性。取24μg純化后的PAPP-A加等體積福氏佐劑免疫Balb／c小鼠，共3次，融合前3天加強(qiáng)免疫1次，用聚乙二醇(PEG)行細(xì)胞融合，用雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT)及次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)選擇性培養(yǎng)，間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選培養(yǎng)上清，包被的抗原為純化后的PAPP-A，選擇對PAPP-A陽性的多克隆孔進(jìn)行亞克隆，間接ELISA篩選亞克隆板孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清。擴(kuò)大培養(yǎng)分泌PAPP-A單克隆抗體的細(xì)胞株，以5×10~5-1×10~6個細(xì)胞／只接種于一周前腹腔注射0.5ml／只液體石蠟油的Balb／c小鼠。接種后7天開始收集腹水，間接ELISA檢測腹水PAPP-A抗體滴度，所得腹水用蛋白A親和層析柱純化單抗，對得到單克隆抗體進(jìn)行分析鑒定。 結(jié)果：純化的PAPP-A蛋白行SDS-PAGE電泳顯示主條帶為PAPP-A亞基的位置，其分子量大小約200 kDa，proMBP亞基的分子量大小約50-90 kDa。PAPP-A亞基可與PAPP-A單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。篩選出12株穩(wěn)定分泌PAPP-A McAbs的雜交瘤細(xì)胞株，8株是IgG1亞型，4株是IgG2a亞型。單抗SDS-PAGE分析顯示輕鏈分子量約為28.7kDa，重鏈約為51.3 kDa。Western blotting和免疫組織化學(xué)分析證實(shí)所獲得的McAb對PAPP-A有較高的特異性及敏感性。 結(jié)論：從孕婦血清中成功分離得到妊娠血漿相關(guān)蛋白A，并獲得穩(wěn)定分泌抗人PAPP-A單克隆抗體的細(xì)胞株，制備出抗人PAPP-A的單克隆抗體�？捎糜赑APP-A免疫檢測方法的建立。
[Abstract]:Background: Pregnancy-associated Plasma Protein PAPP-A is a macromolecular glycoprotein associated with pregnancy, mainly produced by placenta syncytiotrophoblast and decidua. The maternal serum PAPP-A content is closely related to the pregnancy cycle and increases continuously with the increase of gestational week, and reaches its peak at the end of pregnancy. PAPP-A is a sensitive and specific serum marker in maternal blood during early pregnancy. The low level of PAPP-A in maternal blood in early pregnancy is related to the subsequent abnormal pregnancy, such as chromosomal abnormalities, fetal malformations, obstetric complications and so on. At present, the determination of serum PAPP-A in pregnant women during early pregnancy has been applied to predict clinical abnormal pregnancy, especially for the screening of chromosomal abnormalities such as Down's syndrome. Because the low level of PAPP-A in maternal blood is associated with abnormal placental function, PAPP-A is a valuable index to predict abnormal pregnancy in early pregnancy. Recent studies have shown that PAPP-A is a new marker for early identification, risk stratification and prognostic evaluation of acute coronary syndrome. Objective: to isolate and purify PAPP-A protein from the serum of healthy pregnant women, immunize mice with purified antigen, screen hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against PAPP-A, and prepare monoclonal antibodies against human PAPP-A. To provide a basis for the establishment of PAPP-A detection method and its clinical application. Methods: DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange and Heparin-Sepharose CL-6B affinity chromatography were used to isolate and purify PAPP-A, denatured SDS-PAGE from late pregnancy serum. The relative molecular weight of PAPP-A, denatured SDS-PAGE was 200 kDa,western blotting to identify its specificity. Balb/c mice were immunized with 24 渭 g purified PAPP-A and equal volume Freund's adjuvant for 3 times. The mice were immunized once 3 days before fusion. The cells were fused with polyethylene glycol (PEG). Hypoxanthine and aminopterin were used as the selective culture medium of hybridoma cells. Thymidine (HAT), Hypoxanthine and thymine nucleoside (HT) were selectively cultured. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to screen the supernatant of the culture supernatant. The coated antigen was the purified PAPP-A, to subclone the PAPP-A positive polyclonal pore. Indirect ELISA was used to screen the supernatant of cell culture. The cell lines secreting monoclonal antibody to PAPP-A were expanded and inoculated with 5 脳 10 ~ (-1) 脳 10 ~ (6) cells / Balb/c mice injected intraperitoneally with 0.5ml/ liquid paraffin one week ago. The ascites were collected 7 days after inoculation. The titer of PAPP-A antibody in ascites was detected by indirect ELISA. The monoclonal antibody was purified by protein A affinity chromatography and the monoclonal antibody was analyzed and identified. Results: the purified PAPP-A protein was identified as the PAPP-A subunit by SDS-PAGE electrophoresis. The molecular weight of its molecular weight was about 200 kDa,proMBP and the molecular weight of the kDa,proMBP subunit was about 50-90 kDa.PAPP-A, which could react specifically with the PAPP-A monoclonal antibody. Twelve hybridoma cell lines stably secreting PAPP-A McAbs were screened, 8 of them were IgG1 subtypes and 4 were IgG2a subtypes. SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of the light chain was about 28.7 kDa, and the heavy chain was about 51.3 kDa.Western blotting. The obtained McAb was confirmed to be specific and sensitive to PAPP-A by immunohistochemical analysis. Conclusion: pregnancy plasma associated protein A was isolated from maternal serum and the cell lines secreting monoclonal antibodies against human PAPP-A were obtained. Monoclonal antibodies against human PAPP-A were prepared. It can be used for the establishment of PAPP-A immunoassay.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R714;R392

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本文編號：2286868