【摘要】： Cul5蛋白作為E3復(fù)合物的一個(gè)支架蛋白,全長(zhǎng)為784個(gè)氨基酸。在體外表達(dá)Cul5全長(zhǎng)蛋白比較困難,我們通過(guò)PCR的方法獲得Cul5蛋白N末端138個(gè)氨基酸的表達(dá)基因,克隆至pRSETB表達(dá)載體中,進(jìn)行融合表達(dá),獲得His-融合的Cul5蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和純化樹(shù)脂純化獲得高純度的Cul5可溶性蛋白,SDS-PAGE鑒定蛋白的分子量為18KD左右。以純化的Cul5蛋白作為抗原免疫雌性Balb/c小鼠,小鼠經(jīng)鑒定產(chǎn)生抗體后,取脾細(xì)胞與處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在濃度為50%的聚乙烯二醇(PEG)的作用下融合,經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng),間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤,獲得了4株特異性分泌抗Cul5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)初步純化雜交瘤細(xì)胞上清,得到高效價(jià)的抗Cul5蛋白單克隆抗體。
[Abstract]:As a scaffold protein of E 3 complex, Cul5 protein is 784 amino acids. It is difficult to express the full-length Cul5 protein in vitro. We obtained 138 amino acid expression genes of the N-terminal of Cul5 protein by PCR method, cloned them into pRSETB expression vector, and obtained the His- fusion Cul5 protein. The high purity Cul5 soluble protein was purified by Ni-NTA affinity purification resin. The molecular weight of the protein was identified as 18KD by SDS-PAGE. The purified Cul5 protein was used as antigen to immunize female Balb/c mice. The spleen cells and SP2/0 myeloma cells in logarithmic growth phase were fused with 50% polyvinylenediol (PEG). Four hybridoma cells secreting monoclonal antibodies to Cul5 protein were obtained by selective culture on HAT medium and indirect ELISA method. A high titer monoclonal antibody against Cul5 protein was obtained by purifying the supernatant of hybridoma cells.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2205071