【摘要】：囊尾蚴引起的囊蟲病是一種能造成很大危害的人畜共患疾病。囊尾蚴能夠在宿主體中存活數(shù)年,而在存活的囊尾蚴周圍只有很輕微的炎癥反應(yīng)。這個(gè)現(xiàn)象表明存活的囊尾蚴可能通過某種機(jī)制維持了宿主和寄生蟲之間的平衡。 Annexin B1是孫樹漢等用免疫篩選法從豬囊尾蚴cDNA文庫中分離得到的一個(gè)新基因,已有研究證實(shí)其屬于annexin家族。Annexin蛋白家族是一群結(jié)構(gòu)相似的Ca~(2+)依賴性磷脂結(jié)合蛋白,存在于大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi),且含量豐富,具有廣泛而重要的生理功能。Annexin B1是扁形動(dòng)物門(platyhelminth)中首次被鑒定的一個(gè)annexin家族成員,研究它的生理功能,不僅可以了解annexin B1對(duì)于豬囊尾蚴的寄生、移行、生長(zhǎng)、發(fā)育等生命活動(dòng)中的重要意義,為治療和預(yù)防該類疾病提供新的藥物靶點(diǎn),而且可以研究annexin在不同生物中的生理功能以及分子進(jìn)化。所以接下來我構(gòu)建了annexin B1的原核非融合表達(dá)載體,表達(dá)并純化了該蛋白。由于在感染豬囊尾蚴的病豬肌肉的免疫組化切片發(fā)現(xiàn):炎癥反應(yīng)強(qiáng)的組織中膜聯(lián)蛋白B1含量明顯比其他組織高。該結(jié)果提示膜聯(lián)蛋白B1有抗炎活性并有可能以某種機(jī)制分泌到細(xì)胞外,因而我做了annexin B1抗炎活性和真核細(xì)胞內(nèi)定位研究。 本研究主要結(jié)果如下: 1.首先我們構(gòu)建了annexin B1的非融合表達(dá)載體,在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高表達(dá),利用annexin的鈣依賴性磷脂結(jié)合活性優(yōu)化了純化方案,建立了簡(jiǎn)便有效并適宜于所有annexin家族成員的純化方法。純化得到了純度大于95%的蛋白,為后續(xù)的功能研究打下了良好的基礎(chǔ)。 2.為研究annexinB1的抗炎活性,我們檢驗(yàn)它是否以界面競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制抑制cPLA2活性。我們運(yùn)用自由脂肪酸探針ADIFAB來檢測(cè)cPLA2活性,并以自行制備的脂質(zhì)體為磷脂底物,來檢測(cè)annexin B1對(duì)cPLA2活性的影響。結(jié)果顯示annexinB1可抑制cPLA2活性,這種抑制作用依賴于適當(dāng)?shù)牡孜镱愋图扳}離子濃度。cPLA2水解磷脂酰膽堿脂質(zhì)體不能被annexinB1抑制,而水解磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體可被annexin B1抑制,并且這種抑制作用是鈣離子依賴的,鈣離子在10~(-3)以下時(shí)這種抑制作用不明顯,符合界面競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。于是我們推論annexin B1在體外可以界面競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制抑制cPLA2活性,具有抗炎功能。
[Abstract]:Cysticercosis caused by cysticercosis is a zoonotic disease that can cause great harm. Cysticercaria can survive in the host for several years, but there is only a slight inflammatory response around the surviving cysticercus. This phenomenon suggests that survival cysticercaria may maintain the balance between host and parasite through some mechanism. Annexin B1 is isolated from pig sac tail by immune screening method by Sun Shuhan et al. A new gene isolated from cDNA library, It has been confirmed that it belongs to the annexin family. Annexin protein family is a group of similar structural Ca2 dependent phospholipid binding proteins, which exists in most eukaryotic cells and is rich in content. Annexin B1 is the first member of annexin family identified in (platyhelminth) of phylum oblate. Studying its physiological function can not only understand the parasitism, migration and growth of annexin B1 to cysticercus cellulosae. The significance of life activities such as development provides new drug targets for the treatment and prevention of these diseases and can be used to study the physiological functions and molecular evolution of annexin in different organisms. So then I constructed the prokaryotic expression vector of annexin B1, expressed and purified the protein. Because of the immunohistochemical section of the infected pig muscle, it was found that the content of integrin B1 in the tissue with strong inflammatory reaction was significantly higher than that in the other tissues. These results suggest that annexin B1 has anti-inflammatory activity and may be secreted out of cells by some mechanism, so I have done anti-inflammatory activity and eukaryotic localization of annexin B1. The main results of this study are as follows: 1. Firstly, we constructed a non-fusion expression vector of annexin B1, which was highly expressed in Escherichia coli. The purification scheme was optimized by using the calcium dependent phospholipid binding activity of annexin. A simple and effective purification method was established for all members of annexin family. The purity of the protein was more than 95%, which laid a good foundation for further functional study. 2. In order to study the anti-inflammatory activity of annexinB1, we examine whether it inhibits cPLA2 activity by interfacial competition mechanism. Free fatty acid probe (ADIFAB) was used to detect the activity of cPLA2 and liposome was used as phospholipid substrate to detect the effect of annexin B1 on the activity of cPLA2. The results showed that annexinB1 could inhibit the activity of cPLA2, which depended on the appropriate substrate type and calcium concentration. The hydrolysis of phosphatidylcholine liposomes could not be inhibited by annexinB1, but the hydrolysis of phosphatidylserine liposomes could be inhibited by annexin B1. The inhibitory effect is dependent on calcium ion. When calcium ion is below 10 ~ (-3), the inhibitory effect is not obvious, which accords with the mechanism of interfacial competition. Therefore, we infer that annexin B1 can inhibit the activity of cPLA2 by the mechanism of interfacial competition in vitro and has anti-inflammatory function.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R363;Q78

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7 吳紅雅邋吳兆U

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