本文選題：RNA干涉　切入點：短發(fā)夾RNA　出處：《沈陽藥科大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指同源雙鏈RNA所引發(fā)的特異序列的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。它被證明是一項能有效而特異地抑制基因表達(dá)的新技術(shù)。腺相關(guān)病毒(adneo-associated virus，AAV)載體是一種有效的核酸遞送載體，可將小片段DNA高效低毒的轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞。多功能轉(zhuǎn)錄因子CTCF(CCCTC-binding factor，CCCTC結(jié)合因子)是多鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，許多報道表明其與腫瘤的發(fā)生及多個基因的調(diào)控有密切的關(guān)系。 本課題旨在利用小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制CTCF在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而研究CTCF改變所致調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的整體性變化，全面揭示CTCF的功能。 本課題首先針對CTCF的mRNA設(shè)計RNAi的靶位，通過篩選確定2個靶位點。構(gòu)建帶有H1啟動子的shRNA通用表達(dá)載體，分別針對2個靶位點構(gòu)建抑制CTCF表達(dá)的病毒包裝質(zhì)粒，包裝重組腺相關(guān)病毒。將重組病毒感染HeLa細(xì)胞后分別挑取能穩(wěn)定表達(dá)shRNA的單細(xì)胞克隆，共得到29株細(xì)胞株。用實時熒光定量PCR法和Western印跡法檢測細(xì)胞克隆的CTCF表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在mRNA水平，以正常HeLa細(xì)胞為對照，GAPDH為內(nèi)參，CTCF的表達(dá)最高可被下調(diào)76％，在蛋白水平，以正常HeLa細(xì)胞為對照，α-actinin為內(nèi)參，CTCF的表達(dá)也被下調(diào)70％左右。在上述研究中，CTCF mRNA下降幅度，蛋白下降幅度與細(xì)胞生長抑制程度之間具有明顯的相關(guān)性，，提示CTCF正常表達(dá)對細(xì)胞生長的重要性。 同時本課題還對脂質(zhì)體DC-chol／DOPE轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行了探討，自己制備了脂質(zhì)體DC-chol／DOPE，并且確定了轉(zhuǎn)染實驗所需的最適濃度和與轉(zhuǎn)入DNA的最佳比例。利用此方法方便快速的大量制備重組腺相關(guān)病毒獲得成功。 本課題為整體性的研究CTCF基因抑制后相關(guān)表達(dá)譜的改變提供了重要的實驗依據(jù)和必要的技術(shù)支持。
[Abstract]:RNA interference RNAi refers to post-transcriptional gene silencing of specific sequences induced by homologous double-stranded RNA.It has proved to be a new technique that can inhibit gene expression effectively and specifically.Adeno-associated virus (AAVV) vector is an effective nucleic acid delivery vector, which can transfer small fragments of DNA into mammalian cells with high efficiency and low toxicity.Multifunctional transcription factor (CTCF(CCCTC-binding factor-CCCTC binding factor) is a polyzinc finger structural protein, which has been reported to be closely related to tumorigenesis and the regulation of multiple genes.The purpose of this study was to inhibit the expression of CTCF in HeLa cells by using small interference RNA(small interfering siRNAs, and then to study the integrity changes of regulatory networks caused by CTCF changes, and to reveal the function of CTCF.In this paper, the target of RNAi is designed for mRNA of CTCF, and two target sites are determined by screening.The shRNA universal expression vector with H1 promoter was constructed, and the viral packaging plasmids which inhibited the expression of CTCF were constructed for two target sites respectively, and the recombinant adeno-associated virus was packaged.After the recombinant virus was infected with HeLa cells, 29 cell lines were isolated from the single cell clones which could stably express shRNA.The expression of CTCF was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting.The results showed that the expression of mRNA could be down-regulated by 76% at the level of normal HeLa cells, and 70% by 偽 -actinin at the protein level.In the above studies, there was a significant correlation between the decrease of CTCF mRNA, the decrease of protein and the degree of cell growth inhibition, suggesting the importance of normal expression of CTCF for cell growth.At the same time, the method of transfection of liposome DC-chol/DOPE was also discussed. The liposome DC-chol-DOPEwas prepared by itself, and the optimal concentration and the optimal proportion of the liposome into DNA were determined.The method is convenient and rapid to prepare recombinant adeno-associated virus.This study provides an important experimental basis and necessary technical support for the overall study of the changes of related expression profiles after CTCF gene suppression.
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

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本文編號：1716047