本文選題：分枝桿菌　切入點：結(jié)核　出處：《四川大學(xué)》2006年博士論文

【摘要】： 結(jié)核病(TB)是當(dāng)今全球范圍對人類最具威脅性的感染性疾病之一，是單病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，全球每年死于結(jié)核病的人數(shù)接近200萬。中國是全球結(jié)核病的重災(zāi)區(qū)，結(jié)核病發(fā)病總?cè)藬?shù)居全球第二，每年死于結(jié)核病者約25萬，結(jié)核病奪去的生命多于其它所有傳染病所造成死亡例數(shù)的總和。耐藥結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)生和傳播及結(jié)核合并HIV感染是造成近年來結(jié)核病死灰復(fù)燃、卷土重來的主要原因。目前對結(jié)核病治療主要使用化學(xué)藥物，然而由于抗結(jié)核藥物的不規(guī)范治療，病人體內(nèi)的結(jié)核菌對多種抗結(jié)核藥物發(fā)生耐藥，從而形成耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)，這是結(jié)核病疫情重新上升的最主要的原因之一。中國結(jié)核病疫情的主要特點之一就是耐藥率高，耐多藥結(jié)核病人數(shù)居全球第一。因此深入開展結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制研究及在此基礎(chǔ)上建立適合臨床應(yīng)用的快速耐藥檢測方法，對于指導(dǎo)結(jié)核病臨床治療，控制耐多藥結(jié)核病的傳播，以及開發(fā)新型抗結(jié)核藥物均具有重大的理論意義和實用價值。 利福平(rifampin，RFP)和異煙肼(Isoniazid，INH)作為快速全效殺菌劑，是目前最重要的一線抗結(jié)核藥物，是當(dāng)今短程抗結(jié)核化療的基礎(chǔ)。在結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制的研究中占據(jù)重要地位。乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)也是重要的一線抗結(jié)核藥物，具有廣譜抗分枝桿菌活性。然而分枝桿菌對EMB產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制仍不十分清楚，各國學(xué)者的研究報道仍存在較多爭議，亟待進(jìn)一步研究。本文應(yīng)用DNA測序技術(shù)分析87株來源于河南省結(jié)核病耐藥監(jiān)測項目收集的結(jié)核分枝桿菌分離株，其中對RFP、INH、鏈霉素(streptmycin，SM)和EMB均敏感的35株，具有不同耐藥模式的耐藥株52例，其中耐RFP 47例，，耐INH 49例，耐EMB 28例。對所有菌株的耐藥相關(guān)基因rpoB、katG、inhA調(diào)節(jié)區(qū)和embB的突變熱點區(qū)同時進(jìn)行基因型分析。結(jié)果顯示47例耐RFP分離株中，43株(91．5％)在利福平耐藥性決定區(qū)(RRDR，rifampin risistant determination region)出現(xiàn)基因突變。共檢出15種錯義突變類型，涉及15種氨基酸改變。最常見的突變類型發(fā)生在531密碼子上，共占全部突變株的58．1％(25／43)。49例耐INH分離株中，36例(73．5％)檢出基因突變，且發(fā)生在315密碼子位點。序列分析覆蓋了inhA調(diào)節(jié)區(qū)的DNA序列，共檢出4例(8．2％，4／49)在-15堿基位點發(fā)生C→T的置換。其中，1例同時伴隨katG點突變，另3例不伴隨katG點突變。79．6％(39／49)的耐INH分離株至少在katG 315位點或inhA調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生一種突變。28例EMB耐藥株中，16例(53．4％)在embB 306密碼子發(fā)生基因突變，突變類型包括M306V(ATG→GTG)，M306L(ATG→CTG)，M306I(ATG→ATA)，M306I(ATG→ATT)和M306I(ATG→ATC)5種類型。其中M306I(ATG→ATC)突變類型為國內(nèi)首次報道。 在24例對EMB敏感而對RFP和INH耐藥的菌株中，4例(16．7％)也在306密碼子位點檢出基因突變。而對RFP、INH、SM和EMB均敏感的35例結(jié)核分枝桿菌分離株中，它們的rpoB、katG、inhA調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因均未檢出相應(yīng)的突變。對rpoB、katG與embB306位點的突變對比分析。研究結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌耐RFP主要由rpoB基因突變引起，最常見的突變類型發(fā)生在531密碼子。耐INH與katG基因和inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)突變有關(guān)，且katG 315密碼子位點突變是主要因素。研究結(jié)果也初步揭示embB306位突變可能并不是結(jié)核分枝桿菌對EMB產(chǎn)生耐藥的直接原因，而可能與耐多藥產(chǎn)生相關(guān)。 本文首次對耐藥結(jié)核分枝桿菌embB306位點與rpoB基因和katG基因突變的相關(guān)性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明耐藥結(jié)核分枝桿菌embB306位點突變同時伴隨rpoB基因突變?yōu)?00％(19／19)，高于同時伴隨katG315位點突變(73．7％，14／19)。為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌耐多藥與EMB耐受的分子機(jī)制提供了必要的信息。本研究結(jié)果為研制和開發(fā)耐藥結(jié)核分枝桿菌快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。 長期以來結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗一直是結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷中至關(guān)重要的技術(shù)。但傳統(tǒng)的結(jié)核病藥敏檢測方法為表型耐藥檢測方法，其建立在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基礎(chǔ)之上，通常至少需要4到6周的時間，遠(yuǎn)不能滿足臨床治療的需要。因此基于當(dāng)前結(jié)核病分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，本文建立和評價了一種新型的快速進(jìn)行利福平和異煙肼耐藥檢測的反向系列探針雜交方法。應(yīng)用該方法設(shè)計了一個放置了18條探針的多重寡核苷酸探針陣列，可以同時檢測與FRP和INH耐藥相關(guān)的rpoB、katG、inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和ahpC基因內(nèi)間隔區(qū)的堿基突變，并同時可對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行鑒別診斷。應(yīng)用本研究建立的方法檢測52株耐多藥結(jié)核分枝桿菌，46株(88．5％)在rpoB突變熱點區(qū)檢出突變。與rpoB的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果對比分析，探針陣列上野生型探針檢測RFP耐藥與測序的結(jié)果符合率是98．1％(51／52)，突變型探針檢測結(jié)果的符合率是100％(52／52)。應(yīng)用本研究建立的方法，86．5％(45／52)的耐INH分離株在katG315位點，或inhA調(diào)節(jié)區(qū)，或ahpC基因內(nèi)間隔區(qū)檢測到至少一種突變。選擇10例INH耐藥和10例INH敏感株，對katG、inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和ahpC基因內(nèi)間隔區(qū)進(jìn)行測序分析，探針陣列上野生型探針和突變型探針的檢測結(jié)果均與測序結(jié)果一致。應(yīng)用該方法檢測35例敏感株的耐藥相關(guān)基因，均未檢出突變。總體上，與傳統(tǒng)的表型耐藥檢測結(jié)果相比，反向系列探針雜交方法檢測RFP耐藥的敏感性是88．5％(46／52)，特異性是100％(35／35)；檢測INH耐藥的敏感性是86．5％(45／52)，特異性是100％(35／35)。反向系列探針雜交方法提供了一次雜交實驗即可快速獲得結(jié)核桿菌對多種藥物的耐受信息，使得結(jié)核桿菌分離株耐藥性檢測從常規(guī)的4—6周的時間縮短到6—8h，充分顯示了常規(guī)方法不可比擬的優(yōu)越性。因此有可能發(fā)展成為應(yīng)用于臨床快速耐藥檢測的新方法，這種反向系列探針雜交方法也可以用于耐多藥結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查和研究，為耐藥結(jié)核病的控制起到重要作用。 目前分枝桿菌的發(fā)病率也呈上升趨勢，由于非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)對大多數(shù)抗結(jié)核藥物天然耐受，并且NTM的傳播途徑與結(jié)核病的人—人的傳播途徑不同，因此快速、準(zhǔn)確對結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病進(jìn)行鑒別診斷，并針對性的對患者采取有效的治療和控制措施非常重要。傳統(tǒng)的分枝桿菌菌株鑒定方法經(jīng)常與藥敏檢測同步進(jìn)行，也是建立在分枝桿菌的培養(yǎng)基礎(chǔ)之上，費時、費力，且時常不能給出明確的結(jié)果，難以滿足臨床治療的需要。因而建立結(jié)核分枝桿菌快速耐藥檢測方法的同時，不可回避地需要建立對分枝桿菌同步進(jìn)行快速菌種鑒定的檢測方法�；诜聪蛳盗刑结橂s交技術(shù)，本研究選擇分枝桿菌16S—23S rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(16S—23S rRNA gene internal transcripted spacer)為靶DNA序列，設(shè)計一個新型的多重寡核苷酸探針陣列，包括16個屬、群和種特異性探針。應(yīng)用該技術(shù)檢測126例來自中國河南省結(jié)核病耐藥監(jiān)測項目的臨床分枝桿菌分離株。其中結(jié)核分枝桿菌56株，牛型分枝桿菌8株，非結(jié)核分枝桿菌62株。結(jié)果顯示多重探針陣列中分枝桿菌屬特異探針和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群群特異探針具有100％的特異性和敏感性。80．4％(50／62)的非結(jié)核分枝桿菌分離株被直接鑒定到種的水平。通過BLAST和RIDOM對國際上現(xiàn)存的16S—23S rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列進(jìn)行比對分析，并結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)存在多態(tài)性。本研究所發(fā)現(xiàn)的一些新的分枝桿菌基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列型(sequevar)已經(jīng)在Genbank中登記。反向系列探針技術(shù)從分枝桿菌菌株處理到菌種鑒定結(jié)果判斷僅需6—8個h，與傳統(tǒng)所需4—6周的時間相比，顯示了巨大優(yōu)越性。并且通過大量的整合試驗，本探針陣列從菌株DNA提取、PCR擴(kuò)增、分子雜交和酶聯(lián)顯色全套過程可以與結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測探針陣列同步進(jìn)行，成為結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測的配套技術(shù)。隨著在Genbank中積累更多的分枝桿菌基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列信息，對設(shè)計的探針進(jìn)一步完善和優(yōu)化，本研究建立的反向系列探針技術(shù)有可能成為臨床快速、準(zhǔn)確進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定的新方法。 本文在對結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)上，依據(jù)本研究建立的寡核苷酸探針陣列核心技術(shù)平臺，建立了一套可以同步進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌RFP、INH耐藥基因快速檢測和分枝桿菌快速菌種鑒定的反向系列探針雜交技術(shù)。本文研究結(jié)果這為進(jìn)一步揭示結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制和建立適宜臨床應(yīng)用的快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R378

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本文編號：1684128