本文選題：Elafin　切入點(diǎn)：腺病毒　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2006年博士論文

【摘要】： 第一部分人白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制因子elafin的克隆及重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定與表達(dá) 目的:克隆人白細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)抑制因子elafin基因cDNA,應(yīng)用最新的腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)AdEasy System構(gòu)建含elafin基因重組腺病毒載體Ad-elafin,為進(jìn)一步應(yīng)用其進(jìn)行氣道上皮細(xì)胞黏蛋白(MUC)分泌調(diào)控的研究打下基礎(chǔ)。 方法:(1)抽提人肺總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因片段,elafin目的片段經(jīng)純化雙酶切后亞克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183細(xì)菌內(nèi)和pAdEasy-1行同源重組,篩選陽性克隆,酶切、PCR及測序鑒定,Pac I酶切線性化后脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝,獲得腺病毒載體Ad-elafin,繼之在293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增,利用報(bào)告基因GFP監(jiān)測病毒滴度和感染效率,Western-blot檢測elafin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:(1)經(jīng)RT-PCR獲得377bp的產(chǎn)物,經(jīng)酶切、DNA測序,確定所擴(kuò)增片段為人elafin基因cDNA。(2)質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR鑒定證實(shí)elafin基因重組腺病毒載體Ad-elafin構(gòu)建成功,Western-blot檢測到elafin蛋白的表達(dá)。 結(jié)論:獲得編碼elafin的基因片段,并成功構(gòu)建了腺病毒表達(dá)載
[Abstract]:Part I cloning of human leukocyte elastase inhibitor elafin and construction, identification and expression of recombinant adenovirus expression vector. Objective: to clone the elafin gene of human leucocyte elastase inhibitor, and construct the recombinant adenovirus vector Ad-elafin-containing elafin gene by using the newest adenovirus vector AdEasy System. The study on the regulation of MUC) secretion has laid a foundation for the study. Methods the total RNA of human lung was extracted by reverse transcription reaction. The target gene fragment was amplified by PCR and subcloned into shuttle plasmid pAdTrack-CMV after double enzyme digestion. Homologous recombination was carried out in BJ5183 bacteria and pAdEasy-1 to screen positive clones. The recombinant adenovirus vector Ad-elafinwas obtained and then amplified in 293 cells. The reporter gene GFP was used to detect the viral titer and infection efficiency. The expression of elafin protein was detected by Western-blot. Results the product of 377bp was obtained by RT-PCR. The amplified fragment of human elafin gene cDNA.t2) was confirmed by restriction endonuclease digestion and PCR identification. The recombinant adenovirus vector Ad-elafin of elafin gene was constructed successfully and the expression of elafin protein was detected by Western-blot. Conclusion: the gene fragment encoding elafin was obtained and adenovirus was successfully constructed.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1658394