本文選題：NMDA受體　切入點(diǎn)：NR2A　出處：《浙江大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： NMDA受體是離子型谷氨酸受體的一種亞型,在許多神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能和病理機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用,如突觸可塑性、突觸發(fā)生、疼痛和興奮性神經(jīng)毒性等。研究表明,NMDA受體主要是由2個(gè)NR1和2個(gè)NR2亞單位裝配而成的異四聚體。其中,NR1亞單位有8種轉(zhuǎn)錄剪接變體,是形成功能性NMDA受體通道的必需組分,而NR2亞單位則起調(diào)節(jié)亞單位的作用,包括NR2A-NR2D等4個(gè)相關(guān)基因。NMDA受體亞單位的組成方式限定了許多對(duì)于突觸可塑性非常重要的受體屬性,特別是NR2亞單位在調(diào)節(jié)NMDA受體通道的鎂離子阻滯的電壓依賴性、決定受體通道開放時(shí)程的長(zhǎng)短等都起著非常重要的作用,并且還決定了NMDA受體可以與不同的細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用,而這些胞內(nèi)蛋白恰恰在介導(dǎo)NMDA受體的突觸定位、受體成簇以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多屬性上都相當(dāng)重要。NMDA受體的膜表面分布式樣和突觸定位與突觸強(qiáng)度以及不同類型突觸可塑性的調(diào)節(jié)都具有密切關(guān)系,而這些受體定位和分布的性質(zhì)同樣也是由組成NMDA受體的NR2亞單位的不同屬性決定的,正如以往的研究提示,在成熟神經(jīng)元中,與含有NR2B亞單位的NMDA受體不同,含有NR2A亞單位的NMDA受體幾乎只定位在突觸部位,盡管近來也有文獻(xiàn)指出突觸外也存在含有NR2A亞單位的NMDA受體。另外,有研究提示在突觸形成以前,神經(jīng)元發(fā)育的早期膜表面的NMDA受體就以受體簇的形式沿著樹突干運(yùn)輸了,因此基于形態(tài)描述的受體簇概念并不能完全等同于突觸部位的受體,這樣既便是利用電生理的方法可能也無法檢測(cè)到突觸外的可能存在的受體簇。由于電生理檢測(cè)的方法學(xué)局限性,對(duì)于含有NR2A和NR2B亞單位的NMDA受體膜表面分布式樣的系統(tǒng)而全面的形態(tài)學(xué)分析是非常必要的。 在本研究中,我們制備了抗綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)多克隆抗體的Fab片段,并標(biāo)記上Cy3熒光基團(tuán),可以用來直接標(biāo)記表達(dá)在細(xì)胞表面的具有GFP標(biāo)簽的NR2A或NR2B亞單位蛋白。由于未與NR1亞單位裝配的NR2亞單位滯留在ER上而不能表達(dá)于細(xì)胞膜表面,我們通過活細(xì)胞表面熒光染色轉(zhuǎn)染的NR2亞單位,顯示的是分布于細(xì)胞或培養(yǎng)海馬神經(jīng)元表面的含有NR2A或NR2B的NMDA受體亞型。結(jié)果顯示,含有NR2A亞單位的NMDA受體的膜表面分布比含有NR2B亞單位的NMDA受體更傾向于成簇,并且通過相互掉換NR2A和NR2B亞單位的整個(gè)胞內(nèi)C末端,嵌合NR2A胞內(nèi)C端的NR2B亞單位的膜表面分布變得更容易成簇,而嵌合NR2B胞內(nèi)段的NR2A亞單位分布卻變得彌散。并且,這種NR2A亞單位胞內(nèi)C末端決定的表面NMDA受體成簇特征并非完全依賴于NR2亞單位C末端的PDZ結(jié)合功能域。進(jìn)而,我們還發(fā)現(xiàn)在成熟神經(jīng)元中突觸后支架蛋白PSD-95選擇性地與含有NR2A的NMDA受體簇共定位,而同一家族的另外一種蛋白SAP-102與含有NR2A亞單位或NR2B亞單位的NMDA受體簇共定位卻不存在選擇性。然而,NR2亞單位中與這些支架蛋白相結(jié)合的功能區(qū)卻無法直接解釋NR2A與PSD-95蛋白之間的這種特異性的相互作用。另外,在神經(jīng)元發(fā)育的早期,NR2A亞單位的提前過表達(dá)可以促進(jìn)PSD-95蛋白的提前成簇。綜上所述,我們的結(jié)果顯示,含NR2A的NMDA受體亞型成簇分布,而含NR2B的NMDA受體亞型則以彌散分布為主,并且NMDA受體成簇分布的特征是由NR2A亞單位的胞內(nèi)段決定的,且并沒有明顯的C末端PDZ結(jié)合域的依賴型。同時(shí),與NR2B-NMDA受體亞型相比,突觸后支架蛋白PSD-95與膜表面NR2A-NMDA受體亞型具有一定的選擇選擇性共定位關(guān)系,但似乎不依賴于NR2A與PSD-95之間通過PDZ的結(jié)合,而SAP102與NR2A-和NR2B-NMDA受體的共定位卻無明顯的選擇性。最后我們的結(jié)果顯示NR2A的表達(dá)可以誘導(dǎo)PSD-95的成簇分布。
[Abstract]:NMDA receptor is a subtype of ionotropic glutamate receptor, plays a crucial role in many physiological and pathological mechanisms of the nervous system, such as synaptic plasticity, synaptogenesis, pain and excitotoxicity. Research shows that the NMDA receptor is ISO four dimers composed of 2 NR1 and 2 NR2 subunit assembly. Among them, there are 8 kinds of transcription splice variants of NR1 subunit, is essential for the formation of group NMDA receptor channel function, while the NR2 subunit is the regulatory subunit composition including NR2A-NR2D function, 4 genes related to.NMDA receptor subunit defines many for synaptic plasticity. Receptor properties are important, especially the dependence of the NR2 subunit of voltage in the magnesium ion regulation of NMDA receptor channel block, determine channel open duration and plays a very important role, and also determines the NMDA receptor Can the protein with different intracellular localization and synaptic interactions, these intracellular proteins that guide NMDA receptor in dielectric, receptor clustering and cell signal transduction and many other attributes are very important.NMDA receptor membrane distribution patterns and synaptic localization and synaptic strength and regulation of the same type of synaptic plasticity are closely related the nature of these receptors, localization and distribution is also by the different properties of the NR2 subunit of the NMDA receptor decision, previous studies as that in mature neurons, and containing NR2B subunit of NMDA receptor, containing the NR2A subunit of the NMDA receptor was only located at the synapses, although recently the extrasynaptic also exists with NR2A subunit of the NMDA receptor. In addition, studies suggest that synapse formation in neurons before the early development of NMDA receptor on the membrane surface Receptor clusters form transport along the dendrite, so based on the morphological description of the concept of receptor clusters are not exactly the same as the synapses of receptors, even this is a possible method of using electrophysiological also unable to detect the possible existence of extrasynaptic receptor clusters. Because the electric physiological detection method for distribution system study limitations. NMDA receptor membrane surface patterns containing NR2A and NR2B subunit and comprehensive morphological analysis is very necessary.
In this study, we prepared anti green fluorescent protein synthesis (green fluorescence protein, GFP) polyclonal antibody Fab fragment and Cy3 labeled fluorophores can be used directly labeled with GFP tag expression in NR2A or NR2B cell surface protein subunit and NR1 subunit. The assembly of NR2 the unit stuck in ER and not expressed on the cell surface, we through the NR2 subunit of living cell surface immunofluorescence transfection, shows the distribution of cells or in cultured hippocampal neurons on the surface of NR2B containing NR2A or NMDA receptor subtypes. The results showed that the membrane containing NR2A subunit of NMDA receptor than containing the NR2B subunit of the NMDA receptor is more inclined to Yu Chengcu, and through mutual exchange of NR2A and NR2B subunits of the intracellular C terminus, membrane surface distribution of NR2B subunit of chimeric NR2A intracellular C end becomes more and more easily into clusters, and The NR2A subunit of chimeric NR2B intracellular distribution became dispersed. And surface NMDA receptor clustering characteristic is not end this NR2A subunit of intracellular C decision depends entirely on the ends of NR2 subunit C PDZ binding domain. Furthermore, we also found in mature neuron support protein PSD-95 selectively co localization of NMDA receptor clusters containing NR2A, and the same family of SAP-102 and another protein subunit containing NR2A or NR2B subunits of NMDA receptor clusters co localization does not exist selectivity. However, the functional region of NR2 subunit in combination with the scaffold protein but not directly explain between NR2A and PSD-95 protein the interaction of this specificity. In addition, in the early development of neuron, the NR2A subunit of PSD-95 protein expression in advance can promote the early clustering. In summary, our results show that NR2A containing NMDA receptor Subtype clustering distribution, while the NMDA receptor subtype containing NR2B is diffused, and the characteristics of NMDA receptor clustering distribution is determined by the NR2A subunit of intracellular segment, and there were no obvious C terminal PDZ binding domain dependent. At the same time, compared with the NR2B-NMDA receptor subtype, postsynaptic the surface of NR2A-NMDA scaffold protein PSD-95 and membrane receptor subtype selective with certain Co located, but does not seem to depend on between NR2A and PSD-95 by binding to PDZ, and the co localization of SAP102 and NR2A- and NR2B-NMDA receptors had no obvious selectivity. Finally, our results show that clustered NR2A can induce expression of PSD-95.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R33

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本文編號(hào)：1658169