本文選題：胚胎干細(xì)胞　切入點：Rac1　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景及目的 目前冠心病治療領(lǐng)域最受關(guān)注的新理論和方法是治療性血管新生,其根據(jù)血管發(fā)育原理通過刺激心肌缺血區(qū)小血管生長和側(cè)支循環(huán)形成達(dá)到改善心肌缺血的目的,代表著冠心病治療的新方向。胚胎干細(xì)胞(ESCs)是早期胚胎經(jīng)體外分化建立的多能性細(xì)胞系,體外培養(yǎng)時保持未分化狀態(tài),可以傳代增殖。ESCs具有與早期胚胎細(xì)胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點,是研究哺乳動物個體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機制的理想模型。基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將具有生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能,進而應(yīng)用于基因組功能研究(基因表達(dá)調(diào)控、基因功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物篩選研究)和基因治療研究。在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域,ESCs是公認(rèn)的研究基因轉(zhuǎn)移、基因定位整合的一類極有前途的實驗材料,但實際操作中ESCs外源基因轉(zhuǎn)染方法不夠統(tǒng)一,轉(zhuǎn)染效率差異較大,陽性克隆篩選標(biāo)準(zhǔn)不一致。在體外培養(yǎng)條件下,ESCs于成纖維細(xì)胞形成的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)在白血病抑制因子(LIF)存在時,能夠維持全能干細(xì)胞的分化特性。剔除上述因素后,ESCs可以自發(fā)地分化成單層細(xì)胞并聚集生長成胚胎小體(EBs)。EBs模型可以模擬胚胎早期發(fā)育過程,其結(jié)合基因轉(zhuǎn)染技術(shù)成為血管發(fā)育生物學(xué)的一種重要研究工具。RhoA、Rac1和Cdc42是目前研究最多的Rho家族成員,Rho GTP酶可以調(diào)節(jié)生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),但對血管發(fā)育早期成血管細(xì)胞的增生和分化中的作用還所知甚少。本研究針對小鼠ESCs在不同飼養(yǎng)層細(xì)胞上的生長狀態(tài)進行觀察,并針對外源基因轉(zhuǎn)染小鼠ESCs的不同方法進行比較,探討小鼠ESCs外源基因轉(zhuǎn)染方法的可行性和有效性。同時通過成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+Rac1G12V及pcDNA3.1+Rac1T17N質(zhì)粒的ESCs株所建立的體外發(fā)育EBs模型,探討血管發(fā)育早期Rac1在成血管細(xì)胞來源、血管形成過程中的調(diào)控作用和血管分化的變化規(guī)律,為進一步闡明血管成熟、血管重塑及冠心病治療性血管新生奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)小鼠ESCs株R1(ATCC)培養(yǎng)于絲裂霉素(10mg/L,2h)處理后的飼養(yǎng)層細(xì)胞STO(小鼠成纖維細(xì)胞株,ATCC)或MEF(本室制備)上。ESCs在生長到亞融合狀態(tài)時進行傳代,每天換液以維持其未分化狀態(tài)。 2.載體構(gòu)建pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V質(zhì)粒經(jīng)擴增、測序、酶切線性化并回收純化。將更換為PGK啟動子的pEGFP-C1以及pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V質(zhì)粒行KpnⅠ/ApaⅠ雙酶切,目的片斷回收后,行連接反應(yīng),轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,提取新構(gòu)建質(zhì)粒pPGK-Rac1G12V和pPGK-Rac1T17N,酶切鑒定并送測序。 3. ESCs轉(zhuǎn)染用電穿孔法將線性化的pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+ Rac1G12V載體轉(zhuǎn)染到ESCs R1細(xì)胞。按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明,將pPGK-Rac1G12V和pPGK-Rac1T17N質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到ESCs R1細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的ESCs在含G418的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)和篩選。將擴增后10d的轉(zhuǎn)基因ESCs于解剖顯微鏡下用Pasteur槍頭挑取1.5～2mm的細(xì)胞克隆行擴增培養(yǎng)。 4.基因組PCR鑒定應(yīng)用Taq PCR試劑盒行基因組DNA PCR分析。所擴增片段為pcDNA3.1+載體中neomycin的cDNA序列。 5. ESCs分化及EBs模型的建立ESCs培養(yǎng)至亞融合狀態(tài),用0.25%胰酶及0.53mmol/L EDTA消化后,鋪于明膠包被的培養(yǎng)皿中,3h后大部分STO細(xì)胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)液為不含LIF的ESCs培養(yǎng)液。懸浮培養(yǎng)后6d,將EBs接種于0.1%明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng),每天換液。 6.免疫細(xì)胞化學(xué)染色固定的EBs經(jīng)0.05 mol/L TBS洗滌后,在含0.25% Triton X-100和0.5 mol/L NH4Cl的TBS中通透20min。正常山羊血清封閉1h后,與一抗在4℃孵育過夜。抗小鼠抗體包括Rac1、CD31、SMα-actin及Caspase-3。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)或異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗體。 7. RT-PCR參照說明書用Trizol提取不同時間點EBs中的RNA。取RNA1μg進行以下物質(zhì)的半定量PCR:CD31、SMα-actin及GAPDH。 8. SDS-PAGE電泳及Western blot分析通過PULL DOWN分析來檢測轉(zhuǎn)染后ESCs、EBs中Rac1的表達(dá)活性。將收集的不同活性Rac1蛋白或其他蛋白,分別行12%SDS-PAGE電泳。一抗4℃雜交過夜,二抗(HRP標(biāo)記的IgG)室溫雜交2h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影,于暗室條件下壓X光片。 結(jié)果 1.飼養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)及ESCs R1的生長狀態(tài)MEF為長梭形細(xì)胞,呈條索狀或漩渦狀生長。而STO呈現(xiàn)短梭形,細(xì)胞形態(tài)整齊、邊緣清晰。在MEF飼養(yǎng)層上,R1克隆致密,呈橢圓形生長,界限清楚,核仁清晰,ESCs之間看不清細(xì)胞界限。在STO飼養(yǎng)層上,R1呈巢狀(集落狀)隆起生長,邊緣清楚,表面平滑,結(jié)構(gòu)致密,以圓形為主,細(xì)胞核及核仁無法辨認(rèn)。 2.不同飼養(yǎng)層來源的ESCs培養(yǎng)為EBs的比較培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),STO上生長的ESCs盡管生長速度較慢,但發(fā)育為EBs的形成率較高(約40%),結(jié)構(gòu)致密,且多數(shù)能夠發(fā)育出三胚層結(jié)構(gòu)。而MEF上生長的ESCs,生長速度較快,但較容易分化,結(jié)構(gòu)較疏松,培養(yǎng)成EBs的形成率較低(約10%),且不易分化形成三胚層結(jié)構(gòu)。 3.載體構(gòu)建及陽性ESCs克隆篩選pPGK-EGFP-Rac1G12V、pPGK- EGFP-Rac1T17N載體經(jīng)KpnⅠ/ApaⅠ雙酶切后鑒定,與預(yù)期片斷大小一致,送TAKALA公司測序顯示載體中所插入Rac1G12V、Rac1T17N片斷與載體庫中序列完全一致,并且與PGK、EGFP方向一致。電穿孔行G418篩選48h后轉(zhuǎn)染陰性細(xì)胞死亡明顯增加,到第5d大部分未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞團已經(jīng)死亡,繼續(xù)培養(yǎng)至10d左右,可觀察到小的陽性細(xì)胞克隆。共擴增兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞22株。經(jīng)基因組PCR證實,每組各有3株為成功轉(zhuǎn)染克隆。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后24h可以觀察到陽性克隆表達(dá)EGFP,但不同飼養(yǎng)層上的ESCs R1轉(zhuǎn)染效率不同。MEF上的ESCs R1轉(zhuǎn)染效率較高,為60.7±11.4%,而STO上生長的ESCs R1轉(zhuǎn)染效率較低,10.8±7.5%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 4. RT-PCR及Western blot檢測ESCs及EBs中的Rac1表達(dá)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V的ESCs及其來源的EBs,其Rac1 mRNA與蛋白表達(dá)無差異,而PULL DOWN顯示活性Rac1蛋白表達(dá)在Rac1G12V EBs中增加3～4倍,在Rac1T17N EBs中明顯減少。 5. EBs模型的建立及形態(tài)特征培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后ESCs,建立EBs模型,模擬血管發(fā)生及血管新生過程,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染持續(xù)活化型Rac1G12V質(zhì)粒的ESCs可以象野生型ESCs一樣,發(fā)育成為致密結(jié)構(gòu)的EBs,7～9d分化形成三胚層結(jié)構(gòu),而轉(zhuǎn)染主導(dǎo)抑制型Rac1T17N質(zhì)粒的ESCs發(fā)育成的EBs結(jié)構(gòu)疏松,不能分化形成完整的三胚層結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)染Rac1G12V的ESCs形成EBs過程中囊腔細(xì)胞凋亡發(fā)生較早,并可見CD31陽性標(biāo)志的細(xì)胞出現(xiàn),而轉(zhuǎn)染Rac1T17N的ESCs形成EBs過程中囊腔細(xì)胞凋亡發(fā)生較晚,無CD31陽性標(biāo)志的細(xì)胞出現(xiàn)。 6. EBs貼壁分化模型觀察將轉(zhuǎn)染兩種調(diào)控型ESCs來源的EBs貼壁培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染Rac1G12V的EBs細(xì)胞分化活躍、遷移明顯,Rhodamine-Phalloidine染色見細(xì)胞骨架完整、應(yīng)力纖維分布均勻,部分游走細(xì)胞脫離EBs,可見CD31、SMα-actin染色陽性;而Rac1T17N來源的EBs細(xì)胞分化受阻、遷移受限,EBs邊緣的細(xì)胞Rhodamine-Phalloidine染色見應(yīng)力纖維較少,較多集中在胞膜附近,無細(xì)胞游走出現(xiàn)。RT-PCR和Western blot顯示前者CD31 RNA及蛋白表達(dá)時相較早,于E6+6d開始表達(dá),后者表達(dá)較晚且表達(dá)量較少。轉(zhuǎn)染Rac1G12V的EBs貼壁分化后可以形成內(nèi)皮為主的血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)(細(xì)胞吞噬DiI LDL活躍),而Rac1T17N來源的EBs貼壁培養(yǎng)無血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(細(xì)胞吞噬DiI LDL較少)。 結(jié)論 轉(zhuǎn)染Rac1不同調(diào)控型質(zhì)粒建立EBs模型,可以模擬胚胎發(fā)育早期血管發(fā)育過程,觀察Rac1在其中的調(diào)控作用。Rac1在胚胎發(fā)育早期是調(diào)控胚層分化的必須基因,調(diào)控囊腔細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)發(fā)生、ECs游走等過程,進而調(diào)控血管發(fā)育進程。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ESCs是一種高效實用的轉(zhuǎn)染方法,但易用MEF作為飼養(yǎng)層進行轉(zhuǎn)染,STO可作為藥物篩選及培養(yǎng)EBs的首選飼養(yǎng)層細(xì)胞。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R541.4;R321

【引證文獻】

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1 劉娜;補腎生血法對慢性再生障礙性貧血骨髓造血粘附FAK/PI3K通路及Rho GTP酶的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2011年

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本文編號：1651956