本文選題：胚胎干細胞　切入點：Rac1　出處：《第四軍醫(yī)大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 研究背景及目的 目前冠心病治療領域最受關注的新理論和方法是治療性血管新生,其根據血管發(fā)育原理通過刺激心肌缺血區(qū)小血管生長和側支循環(huán)形成達到改善心肌缺血的目的,代表著冠心病治療的新方向。胚胎干細胞(ESCs)是早期胚胎經體外分化建立的多能性細胞系,體外培養(yǎng)時保持未分化狀態(tài),可以傳代增殖。ESCs具有與早期胚胎細胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點,是研究哺乳動物個體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機制的理想模型。基因轉染技術是將具有生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能,進而應用于基因組功能研究(基因表達調控、基因功能、信號轉導和藥物篩選研究)和基因治療研究。在轉基因領域,ESCs是公認的研究基因轉移、基因定位整合的一類極有前途的實驗材料,但實際操作中ESCs外源基因轉染方法不夠統(tǒng)一,轉染效率差異較大,陽性克隆篩選標準不一致。在體外培養(yǎng)條件下,ESCs于成纖維細胞形成的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)在白血病抑制因子(LIF)存在時,能夠維持全能干細胞的分化特性。剔除上述因素后,ESCs可以自發(fā)地分化成單層細胞并聚集生長成胚胎小體(EBs)。EBs模型可以模擬胚胎早期發(fā)育過程,其結合基因轉染技術成為血管發(fā)育生物學的一種重要研究工具。RhoA、Rac1和Cdc42是目前研究最多的Rho家族成員,Rho GTP酶可以調節(jié)生長因子的信號轉導,但對血管發(fā)育早期成血管細胞的增生和分化中的作用還所知甚少。本研究針對小鼠ESCs在不同飼養(yǎng)層細胞上的生長狀態(tài)進行觀察,并針對外源基因轉染小鼠ESCs的不同方法進行比較,探討小鼠ESCs外源基因轉染方法的可行性和有效性。同時通過成功轉染pcDNA3.1+Rac1G12V及pcDNA3.1+Rac1T17N質粒的ESCs株所建立的體外發(fā)育EBs模型,探討血管發(fā)育早期Rac1在成血管細胞來源、血管形成過程中的調控作用和血管分化的變化規(guī)律,為進一步闡明血管成熟、血管重塑及冠心病治療性血管新生奠定基礎。 材料與方法 1.細胞培養(yǎng)小鼠ESCs株R1(ATCC)培養(yǎng)于絲裂霉素(10mg/L,2h)處理后的飼養(yǎng)層細胞STO(小鼠成纖維細胞株,ATCC)或MEF(本室制備)上。ESCs在生長到亞融合狀態(tài)時進行傳代,每天換液以維持其未分化狀態(tài)。 2.載體構建pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V質粒經擴增、測序、酶切線性化并回收純化。將更換為PGK啟動子的pEGFP-C1以及pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V質粒行KpnⅠ/ApaⅠ雙酶切,目的片斷回收后,行連接反應,轉化感受態(tài)細胞,提取新構建質粒pPGK-Rac1G12V和pPGK-Rac1T17N,酶切鑒定并送測序。 3. ESCs轉染用電穿孔法將線性化的pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+ Rac1G12V載體轉染到ESCs R1細胞。按Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明,將pPGK-Rac1G12V和pPGK-Rac1T17N質粒轉染到ESCs R1細胞。將轉染后的ESCs在含G418的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)和篩選。將擴增后10d的轉基因ESCs于解剖顯微鏡下用Pasteur槍頭挑取1.5～2mm的細胞克隆行擴增培養(yǎng)。 4.基因組PCR鑒定應用Taq PCR試劑盒行基因組DNA PCR分析。所擴增片段為pcDNA3.1+載體中neomycin的cDNA序列。 5. ESCs分化及EBs模型的建立ESCs培養(yǎng)至亞融合狀態(tài),用0.25%胰酶及0.53mmol/L EDTA消化后,鋪于明膠包被的培養(yǎng)皿中,3h后大部分STO細胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細菌培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)液為不含LIF的ESCs培養(yǎng)液。懸浮培養(yǎng)后6d,將EBs接種于0.1%明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng),每天換液。 6.免疫細胞化學染色固定的EBs經0.05 mol/L TBS洗滌后,在含0.25% Triton X-100和0.5 mol/L NH4Cl的TBS中通透20min。正常山羊血清封閉1h后,與一抗在4℃孵育過夜�？剐∈罂贵w包括Rac1、CD31、SMα-actin及Caspase-3。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)或異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗體。 7. RT-PCR參照說明書用Trizol提取不同時間點EBs中的RNA。取RNA1μg進行以下物質的半定量PCR:CD31、SMα-actin及GAPDH。 8. SDS-PAGE電泳及Western blot分析通過PULL DOWN分析來檢測轉染后ESCs、EBs中Rac1的表達活性。將收集的不同活性Rac1蛋白或其他蛋白,分別行12%SDS-PAGE電泳。一抗4℃雜交過夜,二抗(HRP標記的IgG)室溫雜交2h。ECL化學發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影,于暗室條件下壓X光片。 結果 1.飼養(yǎng)層細胞形態(tài)及ESCs R1的生長狀態(tài)MEF為長梭形細胞,呈條索狀或漩渦狀生長。而STO呈現(xiàn)短梭形,細胞形態(tài)整齊、邊緣清晰。在MEF飼養(yǎng)層上,R1克隆致密,呈橢圓形生長,界限清楚,核仁清晰,ESCs之間看不清細胞界限。在STO飼養(yǎng)層上,R1呈巢狀(集落狀)隆起生長,邊緣清楚,表面平滑,結構致密,以圓形為主,細胞核及核仁無法辨認。 2.不同飼養(yǎng)層來源的ESCs培養(yǎng)為EBs的比較培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),STO上生長的ESCs盡管生長速度較慢,但發(fā)育為EBs的形成率較高(約40%),結構致密,且多數能夠發(fā)育出三胚層結構。而MEF上生長的ESCs,生長速度較快,但較容易分化,結構較疏松,培養(yǎng)成EBs的形成率較低(約10%),且不易分化形成三胚層結構。 3.載體構建及陽性ESCs克隆篩選pPGK-EGFP-Rac1G12V、pPGK- EGFP-Rac1T17N載體經KpnⅠ/ApaⅠ雙酶切后鑒定,與預期片斷大小一致,送TAKALA公司測序顯示載體中所插入Rac1G12V、Rac1T17N片斷與載體庫中序列完全一致,并且與PGK、EGFP方向一致。電穿孔行G418篩選48h后轉染陰性細胞死亡明顯增加,到第5d大部分未轉染的細胞團已經死亡,繼續(xù)培養(yǎng)至10d左右,可觀察到小的陽性細胞克隆。共擴增兩種轉染細胞22株。經基因組PCR證實,每組各有3株為成功轉染克隆。脂質體轉染后24h可以觀察到陽性克隆表達EGFP,但不同飼養(yǎng)層上的ESCs R1轉染效率不同。MEF上的ESCs R1轉染效率較高,為60.7±11.4%,而STO上生長的ESCs R1轉染效率較低,10.8±7.5%,差異有統(tǒng)計學意義。 4. RT-PCR及Western blot檢測ESCs及EBs中的Rac1表達轉染pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V的ESCs及其來源的EBs,其Rac1 mRNA與蛋白表達無差異,而PULL DOWN顯示活性Rac1蛋白表達在Rac1G12V EBs中增加3～4倍,在Rac1T17N EBs中明顯減少。 5. EBs模型的建立及形態(tài)特征培養(yǎng)轉染后ESCs,建立EBs模型,模擬血管發(fā)生及血管新生過程,發(fā)現(xiàn)轉染持續(xù)活化型Rac1G12V質粒的ESCs可以象野生型ESCs一樣,發(fā)育成為致密結構的EBs,7～9d分化形成三胚層結構,而轉染主導抑制型Rac1T17N質粒的ESCs發(fā)育成的EBs結構疏松,不能分化形成完整的三胚層結構。轉染Rac1G12V的ESCs形成EBs過程中囊腔細胞凋亡發(fā)生較早,并可見CD31陽性標志的細胞出現(xiàn),而轉染Rac1T17N的ESCs形成EBs過程中囊腔細胞凋亡發(fā)生較晚,無CD31陽性標志的細胞出現(xiàn)。 6. EBs貼壁分化模型觀察將轉染兩種調控型ESCs來源的EBs貼壁培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),轉染Rac1G12V的EBs細胞分化活躍、遷移明顯,Rhodamine-Phalloidine染色見細胞骨架完整、應力纖維分布均勻,部分游走細胞脫離EBs,可見CD31、SMα-actin染色陽性;而Rac1T17N來源的EBs細胞分化受阻、遷移受限,EBs邊緣的細胞Rhodamine-Phalloidine染色見應力纖維較少,較多集中在胞膜附近,無細胞游走出現(xiàn)。RT-PCR和Western blot顯示前者CD31 RNA及蛋白表達時相較早,于E6+6d開始表達,后者表達較晚且表達量較少。轉染Rac1G12V的EBs貼壁分化后可以形成內皮為主的血管網結構(細胞吞噬DiI LDL活躍),而Rac1T17N來源的EBs貼壁培養(yǎng)無血管網結構出現(xiàn)(細胞吞噬DiI LDL較少)。 結論 轉染Rac1不同調控型質粒建立EBs模型,可以模擬胚胎發(fā)育早期血管發(fā)育過程,觀察Rac1在其中的調控作用。Rac1在胚胎發(fā)育早期是調控胚層分化的必須基因,調控囊腔細胞凋亡、內皮細胞(ECs)發(fā)生、ECs游走等過程,進而調控血管發(fā)育進程。脂質體轉染ESCs是一種高效實用的轉染方法,但易用MEF作為飼養(yǎng)層進行轉染,STO可作為藥物篩選及培養(yǎng)EBs的首選飼養(yǎng)層細胞。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R541.4;R321

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 劉娜;補腎生血法對慢性再生障礙性貧血骨髓造血粘附FAK/PI3K通路及Rho GTP酶的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學;2011年

，

本文編號：1651956