本文選題：果蠅　切入點(diǎn)：乙酰膽堿酯酶　出處：《重慶大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乙酰膽堿酯酶(Acetycholinesterase，AChE)是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種水解酶，經(jīng)典作用是水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)，終止神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。常見的殘留農(nóng)藥主要是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類藥劑，通過抑制昆蟲中樞神經(jīng)中的膽堿酯酶使之死亡而發(fā)揮殺蟲作用。因此，AChE作為此類農(nóng)藥的最適反應(yīng)底物，在農(nóng)藥殘留的快速檢測中得到了廣泛應(yīng)用，尤其是基于AChE的生物傳感器已成為農(nóng)殘檢測中的熱點(diǎn)。 目前，AChE主要從家蠅等敏感昆蟲頭部提取，產(chǎn)量低，成本高、靈敏度變幅大。因此，通過分子生物學(xué)方法克隆敏感AChE基因，構(gòu)建高效表達(dá)載體表達(dá)AChE基因并且分離純化目標(biāo)蛋白，利用基因工程手段大量制備活性蛋白具有重要的研究意義和廣闊的市場前景。果蠅AChE(Drosophila melanogaster AChE，DmAChE)對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感度極高，并且已經(jīng)得到相應(yīng)基因的全長核苷酸序列。畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，，表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。我們構(gòu)建DmAChE的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，目的就是探索AChE基因在P．pastoris表達(dá)系統(tǒng)中高效、穩(wěn)定表達(dá)的條件，為大量制備乙酰膽堿酯酶提供有效的基因工程手段。 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)PCR方法擴(kuò)增DmAChE基因編碼區(qū)全長1.9Kb cDNA序列；選取畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，選用SnaBI／NotI內(nèi)切酶把DmAChE基因克隆于表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-DmAChE。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切驗(yàn)證并且測序后，采用電穿孔法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母表達(dá)菌株KM71，PCR方法檢測重組情況，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。同時(shí)，G418抗性篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。重組酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并應(yīng)用改良的Ellman法檢測表達(dá)產(chǎn)物的AChE活性，于表達(dá)產(chǎn)物上清液中成功的檢測到了乙酰膽堿酯酶活性，并對不同基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物的乙酰膽堿酯酶活性作了初步比較，初步探索了果蠅乙酰膽堿酯酶基因在畢赤酵母中有效表達(dá)的條件，為下一步優(yōu)化表達(dá)條件、分離及純化目的蛋白奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Acetylcholinesterase Acetycholinesterase (Acetycholinesterase AChE) is a hydrolase present in the central nervous system. The classical role of acetylcholinesterase is to hydrolyze the neurotransmitter acetylcholine to stop the transmission of nerve impulses. It can kill insects by inhibiting the death of cholinesterase in the central nervous system of insects. Therefore, ache, as the optimum reactive substrate of this pesticide, has been widely used in rapid detection of pesticide residues. In particular, biosensor based on AChE has become a hot spot in the field of agricultural disability detection. At present, ache is mainly extracted from the head of sensitive insects such as Musca domestica, with low yield, high cost and high sensitivity. Therefore, the sensitive AChE gene was cloned by molecular biological method, and the highly efficient expression vector was constructed to express AChE gene and to isolate and purify the target protein. The preparation of active proteins by means of genetic engineering has important significance and broad market prospect. Drosophila AChE(Drosophila melanogaster ache DmAChE is highly sensitive to organophosphorus and carbamate pesticides. The full-length nucleotide sequence of the corresponding gene has been obtained. Pichia pastoris expression system has become a perfect foreign gene expression system after nearly ten years of development, and it is easy to ferment with high density. The stable integration of the expressed gene in the host genome can effectively secrete and glycosylation of the product and facilitate the economic cultivation. We constructed the Pichia pastoris expression system of DmAChE in order to explore the high efficiency of the AChE gene in the P.pastoris expression system. The stable expression conditions provide an effective genetic engineering method for the preparation of acetylcholinesterase. In this study, the full-length 1.9Kb cDNA sequence of the coding region of DmAChE gene was amplified by molecular biological PCR method, and the expression vector pPIC9K of Pichia pastoris was selected, and the DmAChE gene was cloned into the polyclonal site of the expression vector by SnaBI/NotI endonuclease. The recombinant plasmid pPIC9K-DmAChEwas constructed. The recombinant plasmid was digested and sequenced. The recombinant plasmid was transformed into Pichia pastoris expression strain KM71PCR by electroporation. At the same time, the recombinant yeast was used to induce the expression, and the modified Ellman method was used to detect the AChE activity of the expression product. The acetylcholinesterase activity was successfully detected in the supernatant of the expression product, and the activity of acetylcholinesterase was detected successfully in the supernatant of the expression product. The acetylcholinesterase activity of different gene copy number transformants was compared, and the effective expression conditions of the acetylcholinesterase gene of Drosophila melanogaster in Pichia pastoris were preliminarily explored, which was the next step to optimize the expression conditions of acetylcholinesterase in Pichia pastoris. The separation and purification of the target protein laid the foundation.
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1651414