本文選題：nm23-H1　切入點(diǎn)：重組腺病毒　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【目的】利用復(fù)制缺陷型腺病毒載體和nm23-H1基因構(gòu)建出重組真核表達(dá)載體并鑒定其在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。 【方法】設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)Kpn Ⅰ，Xho Ⅰ的引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從質(zhì)粒pMD18-T-nm23上克隆出nm23-H1cDNA并定向克隆至穿梭載體pShuttle-CMV，構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-nm23，經(jīng)過(guò)Kpn Ⅰ，Xho Ⅰ雙酶切和DNA測(cè)序鑒定后，利用pShuttle-nm23和腺病毒骨架載體pAdEasy-1在細(xì)菌BJ5183菌體內(nèi)進(jìn)行同源重組，卡那霉素篩選，構(gòu)建出重組腺病毒質(zhì)粒rhAdEasy-nm23-H1，重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac Ⅰ酶切鑒定和PCR鑒定后，在工程菌XL10-Gold菌體內(nèi)大量擴(kuò)增，CsCL梯度離心純化重組腺病毒質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞，在AD-293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行腺病毒的包裝擴(kuò)增，測(cè)定重組腺病毒感染性滴度TCID_(50)，，行免疫熒光，免疫組化和Western blot實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)nm23在肺癌細(xì)胞YTMLC和GLC細(xì)胞中的表達(dá)。 【結(jié)果】將nm23-H1cDNA正向連接到穿梭載體pShuttle-CMV上，Kpn Ⅰ，Xho Ⅰ雙酶切能切出460bp的的片段，DNA測(cè)序結(jié)果與Genebank上nm23-H1基因編碼區(qū)完全一致，該重組質(zhì)粒與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在細(xì)菌BJ5183菌體內(nèi)成功進(jìn)行同源重組，并經(jīng)Pac Ⅰ酶切鑒定，得到帶有目的基因的大小為3.0kb或4.5kb的穿梭質(zhì)粒的片段，測(cè)得重組腺病毒感染性滴度為10~7TCID_(50)／mL，經(jīng)免疫熒光，免疫組化和Western blot檢測(cè)，nm23在肺癌細(xì)胞YTMLC和GLC里有表達(dá)。 【結(jié)論】本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出攜帶nm23-H1cDNA的真核表達(dá)載體重組腺病毒rhAdEasy-nm23-H1：并且用該重組腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，證明導(dǎo)入的nm23-H1基因可以在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，為下一步進(jìn)行nm23抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能鑒定打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:[Objective] to construct recombinant eukaryotic expression vector using replication defective adenovirus vector and nm23-H1 gene, and identify its expression in tumor cells in vitro.
[method] designed with restriction sites of Kpn I, Xho I primer, the application of PCR technology to clone nm23-H1cDNA and cloned into the shuttle vector pShuttle-CMV from plasmid pMD18-T-nm23, the recombinant shuttle plasmid pShuttle-nm23, after Kpn I, Xho I double enzyme digestion and DNA sequencing and homologous recombination in bacteria, BJ5183 bacteria the use of pShuttle-nm23 and adenovirus backbone vector pAdEasy-1, kanamycin screening, the recombinant adenovirus plasmid rhAdEasy-nm23-H1, the recombinant adenovirus plasmid by Pac I digestion and PCR assay after amplified in E.coli XL10-Gold in bacteria, CsCL purified recombinant adenovirus plasmid was transfected into AD-293 cells by adenovirus AD-293 cells within the package and amplification of recombinant adenovirus, determination of infectious titer of TCID_ (50), immunofluorescence, immunohistochemistry and Western blot experiments to detect nm23 in lung cancer Expression in cell YTMLC and GLC cells.
[results] the nm23-H1cDNA is connected to the shuttle vector pShuttle-CMV, Kpn I, Xho I double enzyme digestion can be cut out of the 460bp fragment of DNA was proved to be consistent with the Genebank encoding region of nm23-H1 gene, the recombinant plasmid and adenovirus backbone plasmid pAdEasy-1 for homologous recombination in bacteria BJ5183 successfully in bacteria, and by Pac I digestion, get a gene size is 3.0kb or 4.5kb shuttle plasmid fragment obtained recombinant adenovirus infection titer was 10~7TCID_ (50) / mL by immunofluorescence, immunohistochemistry and Western blot assay, the expression of nm23 in YTMLC and GLC lung cancer cells.
[Conclusion] this experiment successfully constructed the eukaryotic expression vector of recombinant adenovirus carrying nm23-H1cDNA and rhAdEasy-nm23-H1 of tumor cells were transfected with the recombinant adenovirus, nm23-H1 gene that can be expressed in tumor cells, and lay the foundation for the functional characterization of nm23 inhibit the metastasis of tumor cells in the next step.

【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1635643