發(fā)布時間：2018-03-19 17:35

  本文選題：p　切入點：RNA干擾　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》2014年12期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的構(gòu)建靶向犬p53基因慢病毒干擾載體,建立穩(wěn)定沉默p53基因的WRD/p53-細胞系。方法設(shè)計并構(gòu)建4條針對犬p53基因的特異性shRNA干擾質(zhì)粒。將構(gòu)建的慢病毒表達載體(p GMLV-p53)和包裝質(zhì)粒(packaging mix)組成的包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝病毒,收集病毒原液,超濾濃縮,并測定滴度。包裝好的慢病毒感染W(wǎng)RD細胞,Western blot和實時熒光定量PCR方法檢測不同靶點RNA干擾載體對p53基因的干擾效果,確定有效靶點。針對有效靶點慢病毒顆粒以最適感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)感染W(wǎng)RD細胞,puromycin抗生素篩選穩(wěn)定感染細胞系WRD/p53-。結(jié)果結(jié)果顯示p53 RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功,成功包裝四種不同靶點的p53基因RNA干擾慢病毒,病毒滴度均達到1×109TU/ml。四種干擾載體慢病毒均具有較好的干擾效果,選用沉默效果最好的p GMLV-p53A1為最優(yōu)靶點,成功建立p53 RNAi慢病毒載體穩(wěn)定感染細胞系WRD/p53-。結(jié)論成功構(gòu)建p53 RNAi慢病毒載體,并有效干擾WRD細胞中p53 mRNA和蛋白表達,同時成功篩選并建立p53RNAi慢病毒穩(wěn)定感染W(wǎng)RD/p53-細胞系。
[Abstract]:Objective to construct the targeting vectors of canine p53 gene lentiviral interference, to establish stable WRD/p53- cell line gene silencing by p53. Methods the design and construction of 4 against canine p53 gene specific shRNA interference plasmid. The constructed lentiviral expression vector (P GMLV-p53) (packaging Mix) and packaging plasmids were transfected into 293T packaging systems consisting of packaging cell, virus, virus stock solution was collected and concentrated by ultrafiltration, and the titer of lentivirus infection. Packaged in WRD cells, Western blot detection and real-time fluorescence quantitative PCR method of jamming effect on p53 gene targeting different RNA interference vector, determine the effective target. The effective target lentiviral particles to the optimal multiplicity of infection (multiplicity of infection, MOI) infection of WRD cells, puromycin cells infected with WRD/p53-. stable antibiotic screening results showed that p53 RNAi lentivirus vector was constructed successfully, four different target packaging success The p53 gene RNA interference lentiviral virus titer reached 1 * four 109TU/ml. interference lentivirus vector has better interference effect, the silencing effect of the best p GMLV-p53A1 is the best target, successfully constructed p53 RNAi lentivirus vector stably infected WRD/p53-. cell line objective to construct p53 RNAi lentivirus vector, and effective jamming the expression of p53 mRNA and protein in WRD cells, and successfully screened and established p53RNAi lentivirus infected WRD/p53- stable cell lines.

【作者單位】： 寧夏醫(yī)科大學(xué)總院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科;寧夏醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81060130)~~
【分類號】：R373

【共引文獻】

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3 劉斌;NOK癌基因?qū)毎芷贕_1/S期的影響及其作用機制探討[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

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本文編號：1635304