本文選題：立氏立克次體　切入點：實時熒光定量PCR　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)是落基山斑點熱(Roeky Mountain Spotted Fever,RMSF)的病原體，為專性細胞內(nèi)寄生的小革蘭氏陰性菌，人對其十分易感。外膜蛋白B(rOmpB)是立氏立克次體最主要的表面蛋白抗原，被認為是發(fā)展落基山斑點熱診斷試劑和亞單位疫苗的靶分子。 本研究首先依據(jù)立氏立克次體ompB基因序列設(shè)計特異性引物和探針，以克隆的ompB基因片段為DNA模板，在ABI 7900型熒光定量PCR檢測儀上建立實時熒光定量PCR檢測方法。建立的定量標準曲線Ct值與模板拷貝數(shù)呈良好線性關(guān)系，最低檢測濃度為5拷貝/μl，與普通PCR相比較，，敏感性是普通PCR的100倍；用該方法檢測其它相關(guān)立克次體和常見非立克次體病原菌，檢出結(jié)果均為陰性。用該熒光定量PCR方法檢測立氏立克次體感染的豚鼠血液標本、小鼠脾臟標本及細胞培養(yǎng)標本，檢測的結(jié)果與立氏立克次體感染進程相關(guān)。表明本研究建立的檢測立氏立克次體實時熒光定量PCR方法具有高特異性和高敏感性，適用于定量檢測各種樣本中的立氏立克次體和立氏立克次體感染早期的實驗室診斷。 本研究還克隆表達了rOmpB的主要抗原片段—120kDa表面蛋白，并對重組蛋白的免疫原性和抗原性進行了研究。利用抗原表位預(yù)測技術(shù)，將120kDa蛋白分為抗原表位比較集中的六段蛋白，通過優(yōu)化條件，利用不含胰化蛋白胨的新型MDG培養(yǎng)基實現(xiàn)了120kDa蛋白和六個蛋白片段在大腸桿菌的表達。免疫印跡分析證明重組蛋白中僅120kDa重組蛋白和5號蛋白(P5)能與立氏立克次體免疫血清特異反應(yīng)。 用純化的七個重組蛋白免疫小鼠，IFA檢測表明120kDa和P5蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性IgG抗體。對免疫小鼠的脾臟做體外淋巴細胞增殖試驗，發(fā)現(xiàn)120kDa蛋白和P5蛋白能誘導(dǎo)較高水平的淋巴細胞增殖。采用RT-PCR方法檢測免疫小鼠脾淋巴細胞被不同蛋白抗原刺激后的細胞因子表達，發(fā)現(xiàn)120kDa蛋白和P5蛋白刺激的小鼠脾淋巴細胞均表達了IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10。結(jié)果證明120kDa蛋白和P5蛋白均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性。對重組蛋白免疫的小鼠進行攻毒試驗，攻毒試驗后小鼠主要臟器內(nèi)病原體載量的定量檢測結(jié)果表明，120kDa和P5重組蛋白組與滅活全菌抗原組之間沒有顯著性的差別，顯示了良好的免疫保護性。 120kDa蛋白和P5蛋白可與立克次體屬的多種立克次體免疫血清發(fā)生交叉反應(yīng)，與貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體不反應(yīng)，提示這兩種蛋白具有立克次體屬特異性。在ELISA實驗中，分別以全菌抗原、120kDa蛋白和P5蛋白為包被抗原檢測立氏立克次體陽性鼠血清的結(jié)果類似，表明作為ELISA診斷的包被抗原，P5蛋白可以取代全菌抗原和重組120kDa蛋白。以IFA結(jié)果為金標準，在立氏立克次體陽性和陰性鼠血清的檢測中，以P5為包被抗原的ELISA方法的敏感性與特異性分別為100％和93.4％，表明重組P5蛋白是一個很有希望的立克次體感染的血清學診斷抗原。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R376

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 吳德平;立氏立克次體主要抗原的免疫原性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2010年

本文編號：1575967