本文選題：漢灘病毒　切入點(diǎn)：囊膜糖蛋白　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由漢坦病毒(Hantanvirus,HV)引起的一種急性病毒性傳染病,臨床上以發(fā)熱、出血、腎功能損害和免疫功能紊亂為突出表現(xiàn)。我國(guó)是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家,流行地區(qū)廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率較高,防治任務(wù)十分艱巨。 HV屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬。目前可將HV分為十種血清型或二十幾種基因型,其中常見的對(duì)人類造成危害比較嚴(yán)重的型別有:漢灘病毒(HTNV)、漢城病毒(SEOV)、普馬拉病毒(PUUV)、辛若柏病毒(SNV)等。 以往國(guó)內(nèi)外的大量研究工作表明,HV的M基因編碼的囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)是重要的結(jié)構(gòu)蛋白,HV的中和抗原表位主要分布在GP上,特別是G2上。GP可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,對(duì)感染動(dòng)物和人體均具有保護(hù)作用。此外,GP還具有血凝活性、細(xì)胞融合活性及受體結(jié)合活性,因此GP被認(rèn)為是一種重要的保護(hù)性抗原,是漢坦病毒基因工程疫苗的主要候選成份。但是,該蛋白免疫原性較弱,已有的抗GP的抗體親和(結(jié)合)活性均不高,并且在目前應(yīng)用比較廣泛的幾種表達(dá)系統(tǒng)中,GP表達(dá)水平亦不理想。因此也尚未建立針對(duì)GP的有效的檢測(cè)方法,這些都使得對(duì)GP的研究受到了很大的限制。 本研究根據(jù)GP上既有中和活性位點(diǎn)又有血凝活性位點(diǎn)的特點(diǎn),利用HTNV 76-118株血凝素免疫小鼠制備單克隆抗體(mAb),并以含有G1、G2編碼基因的真核載體G1-pDisplay、G2-pDisplay轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞篩選抗G1和G2的特異性mAb,對(duì)這些mAb的免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步鑒定;同時(shí)將編碼HTNV 76-118株G2的基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)型表達(dá)載體pPIC3.5K和分泌型表達(dá)載體pPICZαA,轉(zhuǎn)化酵母工程菌株,篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。 1.抗HTNV G1、G2 mAb的制備及鑒定 以蔗糖-丙酮法從HTNV 76-118株感染的乳鼠腦中提取血凝素,以此血凝素免疫BLAB/c小鼠,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,以血凝抑制試驗(yàn)(HIA)進(jìn)行篩選,獲得了4株能穩(wěn)定分泌抗HTNV血凝素mAb的雜交瘤細(xì)胞系,分別命名為1A6、1G12、2B2和2H5。 用分別含有編碼HTNV G1和G2基因的真核表達(dá)載體G1-Display、G2-Display轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,并用此轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)上述4株mAb。結(jié)果表明,mAb 1G12與G1-Display轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng),提示其是G1特異性的;2B2和2H5均與G2-Display轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng),提示它們是G2特異性的;而1A6則與G1-Display轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞和G2-Display轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞均呈陽(yáng)性反應(yīng)。 采用HIA檢測(cè)mAb 1A6、1G12、2B2、2H5腹水的血凝抑制效價(jià),結(jié)果分別為1∶4000、1∶16000、1∶16000和1∶8000。中和試驗(yàn)的結(jié)果表明,4株mAb均有一定的中和活性,最高中和效價(jià)為1∶40。 2.HTNV G2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定 將HTNV 76-118株G2基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)型載體(pPIC3.5K)和分泌型載體(pPICZαA),構(gòu)建了含有編碼HTNV G2蛋白基因的表達(dá)載體pPIC3.5k-G2和pPICZαA-G2,分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌后用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。用SDS-PAGE和Western-Blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,pPICZαA-G2轉(zhuǎn)化菌表達(dá)產(chǎn)物中有與預(yù)期大小相符的目的蛋白條帶,采用抗his的mAb及HFRS患者恢復(fù)期血清的Western-Blot,證實(shí)該條帶為G2蛋白。 本研究獲得的針對(duì)HTNV GP(G1、G2)的特異性mAb以及HTVN G2蛋白,為進(jìn)一步建立HTNV GP的檢測(cè)方法以及HTNV GP的結(jié)構(gòu)與功能研究等提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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