本文選題：脂多糖　切入點(diǎn)：膿毒癥　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 膿毒癥(sepsis)是由各種致病微生物或其毒素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致感染性休克(septic shock)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)和多器官功能障礙綜合征(mutiple organ dysfunction syndrom,MODS)等，膿毒癥及其并發(fā)癥一直是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)患者高發(fā)病率和高死亡率的主要原因，其中SIRS死亡率接近26％，膿毒癥休克的死亡率更可高達(dá)82％。盡管付出了巨大的努力，但由于膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療困難，近40年來(lái)預(yù)后一直沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的改善，已經(jīng)構(gòu)成對(duì)人類健康的嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的巨大負(fù)擔(dān)，是危重病醫(yī)學(xué)面臨的棘手問(wèn)題。 內(nèi)毒素是G~-菌細(xì)胞壁外膜的結(jié)構(gòu)成分之一，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，是引起膿毒癥的主要因素。在SIRS及膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究中，目前較為公認(rèn)的是“二級(jí)炎癥反應(yīng)理論(second hit theory)”：LPS首先誘發(fā)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，后者進(jìn)一步激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種效應(yīng)細(xì)胞，并形成瀑布效應(yīng)，使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大甚至失去控制，最終導(dǎo)致以細(xì)胞自身破壞為特征的全身性炎癥反應(yīng)。LPS作用于單核巨噬細(xì)胞是膿毒癥發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，對(duì)這一環(huán)節(jié)進(jìn)行深入研究并有效干預(yù)，則可以達(dá)到阻止下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而減輕炎癥反應(yīng)的目的。單核巨噬細(xì)胞在受到LPS誘導(dǎo)刺激后，自身的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并導(dǎo)致相應(yīng)的合成和分泌功能發(fā)生變化。與正常單核巨噬細(xì)胞相比較，受刺激細(xì)胞表面許多分子的活性部位暴露，一些與病理相關(guān)的分子新表達(dá)或表達(dá)增高，提示受刺激的細(xì)胞與正常的細(xì)胞表面存在著結(jié)構(gòu)上具有差異的分子，這些分子可能與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并有可能作為膿毒癥治療的靶點(diǎn)。 這些差異分子有可能是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)某些重要炎癥介質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，尋找到這些差異分子的特異性結(jié)合肽，則有可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制相應(yīng)炎癥介質(zhì)與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)而中和或阻斷這些炎癥介質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)，如進(jìn)一步激活靶細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、介導(dǎo)細(xì)胞黏附等，從而達(dá)到阻斷或減輕全身性炎癥反應(yīng)發(fā)生的目的，這種對(duì)特定細(xì)胞具有靶向治療作用的生物活性肽的特點(diǎn)是更為高效和副作用小。其關(guān)鍵步驟為發(fā)現(xiàn)LPS刺激單核巨噬細(xì)胞的特異性高親和力結(jié)合肽。 近年來(lái)，以噬菌體展示(phage display)技術(shù)篩選肽類藥物的蓬勃發(fā)展為解決上述問(wèn)題提供了良好的契機(jī)。已經(jīng)知道，蛋白質(zhì)之間的相互作用和識(shí)別是通過(guò)局部肽段的相互作用實(shí)現(xiàn)的，而含有關(guān)鍵殘基的短肽可以模擬蛋白質(zhì)功能決定簇的作用。因此利用噬菌體展示技術(shù)篩選膿毒癥單核巨噬細(xì)胞的特異性結(jié)合肽(該肽有可能阻斷某些炎癥介質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng))，將為膿毒癥的防治提供新思路。 噬菌體展示技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)，其原理是將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白將展示在噬菌體的表面，而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該噬菌體內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)最基本的特征是將表現(xiàn)型和基因型有效聯(lián)系起來(lái)，，即噬菌體表面的特定表現(xiàn)型與噬菌體顆粒中的基因型信息相對(duì)應(yīng)，如需得到某個(gè)特定的表現(xiàn)型，只需在噬菌體基因組中插入該表現(xiàn)型的相關(guān)基因即可。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽配體通過(guò)一種被稱為淘選(panning)的體外選擇程序得以快速鑒定。最簡(jiǎn)單的淘選程序，是將噬菌體展示肽庫(kù)與包被有靶分子的平板(或磁珠)共溫育，先洗去未結(jié)合噬菌體，然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。被洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行下一輪的結(jié)合／擴(kuò)增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3～4輪淘選后，通過(guò)DNA測(cè)序?qū)γ總�(gè)可結(jié)合克隆進(jìn)行定性。展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫(kù)可應(yīng)用于許多方面，包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬物。生物活性肽分子的鑒定既可通過(guò)對(duì)固定的純化受體進(jìn)行淘選也可在完整細(xì)胞上進(jìn)行淘選。 Ph.D.-C7C噬菌體展示肽庫(kù)是將隨機(jī)七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)上而構(gòu)建成的一個(gè)組合文庫(kù)。所展示的隨機(jī)多肽兩側(cè)各有一個(gè)半胱氨酸(Cys)。在非還原條件下，這兩個(gè)半胱氨酸自發(fā)地形成一個(gè)二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化。受限于二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽庫(kù)已被證實(shí)能識(shí)別抗原表位結(jié)構(gòu)、D-氨基酸靶分子的鏡像配基及開(kāi)發(fā)以多肽為基礎(chǔ)的治療藥物等。 細(xì)胞表面是一個(gè)復(fù)雜的生物體系，分布著大量的信號(hào)分子，這些信號(hào)分子反映了細(xì)胞的特性及其所處的功能狀態(tài)，人們固然可以將這些分子純化作為靶標(biāo)來(lái)篩選細(xì)胞特異性的結(jié)合肽，但對(duì)于純化困難或表達(dá)量少的受體，這種方法顯得力不從心，而且固定的重組受體可能經(jīng)歷構(gòu)像的改變和(或)翻譯后修飾的缺失，另外，許多受體分子需要完整的細(xì)胞膜或與膜上其它亞單位形成復(fù)合物才能發(fā)揮作用。因此，為了解決上述問(wèn)題，并盡可能接近體內(nèi)環(huán)境，以完整細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行篩選不失為一種可嘗試的選擇。本研究即為在靶分子未知的情況下篩選完整細(xì)胞，這種篩選適用于復(fù)雜的經(jīng)常改變細(xì)胞表面的細(xì)胞(如炎癥時(shí)的單核巨噬細(xì)胞等)。 我們選用Giordano等新建立的用于細(xì)胞差減篩選的“一步有機(jī)相分離法——生物淘篩和對(duì)篩選出的反應(yīng)配體的快速分析(biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands，BRASIL)”技術(shù)。其基本原理是：噬菌體肽庫(kù)與正常細(xì)胞孵育后，置于有機(jī)相上層進(jìn)行離心，留在上層水相中的未結(jié)合噬菌體進(jìn)一步與發(fā)生某種病理改變(如LPS刺激)的同種細(xì)胞進(jìn)行孵育，并且再次置于有機(jī)相上層進(jìn)行離心，與病理狀態(tài)的細(xì)胞結(jié)合的噬菌體通過(guò)離心力的作用進(jìn)入有機(jī)相，這些結(jié)合的噬菌體再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染、擴(kuò)增后進(jìn)行下一輪篩選。BRASIL技術(shù)無(wú)需反復(fù)數(shù)輪的洗脫過(guò)程，因此大大減少細(xì)胞和配體的丟失。此外，還具有操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)。我們分別以LPS刺激的THP-1細(xì)胞為特異性結(jié)合靶細(xì)胞，以未經(jīng)LPS刺激的THP-1細(xì)胞為非特異性結(jié)合吸附細(xì)胞，對(duì)噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)進(jìn)行了4輪差減篩選，結(jié)合噬菌體得到較好富集，富集率約為155倍。隨機(jī)選取1，800個(gè)噬菌體克隆，經(jīng)過(guò)細(xì)胞—酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cell-ELISA)驗(yàn)證及DNA測(cè)序鑒定，共獲得了1，033個(gè)陽(yáng)性噬菌體，并根據(jù)插入序列推導(dǎo)出外源七肽的氨基酸序列。 這些七肽序列中包含大量的三肽殘基，其中一些三肽基序作為生化識(shí)別單元(biochemical recognition units)中的配基，往往是某些功能蛋白的模擬表位(mimotopc)，尋找這些模擬表位及其對(duì)應(yīng)的功能蛋白具有重大意義。我們采用隨機(jī)排列檢驗(yàn)(randomized permutation test，RPT)的思想，應(yīng)用混排(洗牌)算法(shuffling algorithm)，統(tǒng)計(jì)大量噬菌體展示七肽中某特定三肽出現(xiàn)的次數(shù)(豐度)及其顯著性，結(jié)果1，033個(gè)陽(yáng)性噬菌體展示七肽中包括有3，085個(gè)不同的三肽殘基，其中豐度超過(guò)15的三肽有8個(gè)，豐度具有顯著性的三肽有4個(gè)。然后，利用Clustal W軟件對(duì)包含豐度具有顯著性或豐度較高的三肽基序的七肽進(jìn)行多序列比對(duì)(multiple sequence alignment)分析，并結(jié)合氨基酸的性質(zhì)，在這些七肽中尋找特征性短肽基序(模擬表位)；通過(guò)在線BLAST服務(wù)，將這些短肽基序同人類蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(SWISS-PROT)進(jìn)行相似性比對(duì)分析，獲得所有已知的包含這些特征性短肽的人類蛋白；進(jìn)一步應(yīng)用SignalP和TMHMM預(yù)測(cè)軟件篩選其中的分泌蛋白和跨膜蛋白，從中獲得目的功能蛋白。經(jīng)過(guò)以上生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，我們獲得了功能蛋白hTNF-α及其表位模擬肽ISPL。 為進(jìn)一步研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選并且經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析得到的短肽基序與細(xì)胞結(jié)合的特異性以及在細(xì)胞上的定位，我們進(jìn)行了細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)KSFISPL噬菌體具有與LPS處理的THP-1細(xì)胞特異性結(jié)合的能力，其結(jié)合部位是細(xì)胞膜。進(jìn)一步應(yīng)用液相蛋白芯片(LiquiChip)技術(shù)檢測(cè)KSFISPL噬菌體對(duì)hTNF-α誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放IL-8的影響，結(jié)果表明KSFISPL噬菌體可以有效抑制hTNF-α誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放IL-8的作用，并且這種作用依賴于噬菌體表面展示的KSFISPL肽。 總之，本研究在靶分子未知的情況下，利用BRASIL技術(shù)，對(duì)LPS刺激和未經(jīng)LPS刺激的單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行4輪反復(fù)“差減篩選”，獲得與LPS刺激的單核巨噬細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽序列，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)這些短肽序列進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，并進(jìn)一步鑒定預(yù)測(cè)得到的功能蛋白和表位模擬肽的生物學(xué)活性。通過(guò)以上研究，我們得出以下幾點(diǎn)結(jié)論： 1．經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，“一步有機(jī)相分離法——生物淘篩和對(duì)篩選出的反應(yīng)配體的快速分析(BRASIL)技術(shù)”這種全新的完整細(xì)胞篩選技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速，可減少細(xì)胞和配體的丟失，增加對(duì)配體回收的靈敏度和特異性，值得推廣應(yīng)用； 2．通過(guò)BRASIL“差減篩選”，獲得了1，033個(gè)與LPS刺激的單核巨噬細(xì)胞特異性結(jié)合的陽(yáng)性噬菌體克隆，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，1，033個(gè)陽(yáng)性噬菌體展示七肽中共包括有3，085個(gè)不同的三肽殘基，其中豐度超過(guò)15的三肽有8個(gè)，豐度具有顯著性的三肽有4個(gè)； 3．應(yīng)用Clustal W軟件并結(jié)合氨基酸性質(zhì)，分別對(duì)包含豐度最高和豐度具有顯著性的三肽基序的所有七肽進(jìn)行多序列比對(duì)分析，獲得了多個(gè)具有表位模擬肽性質(zhì)和功能的特征性短肽； 4．應(yīng)用BLASTP程序與人類蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析得到包含以上特征性短肽基序的已知人類蛋白，進(jìn)一步利用SignalP和TMHMM預(yù)測(cè)軟件獲得分泌蛋白和跨膜蛋白，從中選擇了細(xì)胞因子hTNF-α及其表位模擬肽ISPL進(jìn)行功能鑒定； 5．免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，展示KSFISPL七肽的噬菌體具有與LPS處理的THP-1細(xì)胞特異性結(jié)合的能力，其結(jié)合部位是細(xì)胞膜，并且這種結(jié)合能力依賴于噬菌體表面展示的KSFISPL肽而非噬菌體自身； 6．液相蛋白芯片(LiquiChip)技術(shù)檢測(cè)表明KSFISPL噬菌體可以有效抑制hTNF-α誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放IL-6的作用，這種作用依賴于噬菌體表面展示的KSFISPL肽而非噬菌體自身； 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)獲得原始數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)研究方法分析生物數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)出與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的功能蛋白及其表位模擬肽，再進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，是一條高效的研究途經(jīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R459.7;R363

【參考文獻(xiàn)】

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