發(fā)布時間：2017-09-04 06:27

  本文關(guān)鍵詞：Akt特異性抑制劑對小鼠植入前胚合子基因組激活的影響

  更多相關(guān)文章： p-Ser473-Akt 小鼠植入前胚 2-細(xì)胞阻滯 合子基因組激活

【摘要】：目的:通過觀察Akt特異性抑制劑API-2和MK2206對小鼠1-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響及Akt特異性抑制劑對體外發(fā)育2-細(xì)胞胚內(nèi)Akt主要活性形式p-Ser473-Akt定位與表達(dá)的改變,結(jié)合Akt特異性抑制劑API-2對小鼠合子基因組激活(Zygotic Gene Activation,ZGA)中四個標(biāo)志基因和干細(xì)胞因子Oct4與Sox2的表達(dá)影響,為進(jìn)一步探討Akt在小鼠植入前胚發(fā)育ZGA中可能發(fā)揮的作用提供基礎(chǔ)。方法:1.收集KM小鼠體內(nèi)植入前胚(1-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚),應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)p-Ser473-Akt和總Akt(pan-Akt)的表達(dá)與定位情況。2.收集KM雌性小鼠與KM雄性小鼠交配所得的1-細(xì)胞胚,分別觀察其在KSOM培養(yǎng)液、不同濃度的API-2和MK2206的KSOM培養(yǎng)液中體外發(fā)育的情況;3.收集KM小鼠1-細(xì)胞胚,分別置于KSOM和含API-2(2μM)和MK2206(30μM)的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng),獲取體外發(fā)育的2-細(xì)胞胚,采用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)p-Ser473-Akt和pan-Akt的定位與表達(dá)情況;4.收集KM小鼠1-細(xì)胞胚,分別置于KSOM和含API-2(2μM)的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng),獲取體外發(fā)育的2-細(xì)胞胚,運(yùn)用Real-Time PCR技術(shù)檢測Hsp70.1、Zscan4d、Mu ERV-L和e IF-1A等ZGA標(biāo)志基因m RNA的表達(dá)水平。5.收集KM小鼠1細(xì)胞胚,分別置于KSOM和含API-2(2μM)的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng),獲取體外發(fā)育的2-細(xì)胞胚,運(yùn)用Real-Time PCR技術(shù)檢測干細(xì)胞因子Oct4和Sox2的m RNA表達(dá)水平。結(jié)果:1.p-Ser473-Akt和pan-Akt存在于小鼠植入前胚的1-細(xì)胞至4-細(xì)胞階段。作為Akt主要的活性形式,p-Ser473-Akt在小鼠1-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚內(nèi)定位存在動態(tài)變化,其在1-細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚期間核內(nèi)出現(xiàn)的時間與ZGA發(fā)生的時相(minor ZGA和major ZGA)基本一致。pan-Akt主要分布在胞質(zhì)里,在不同發(fā)育階段的細(xì)胞中其表達(dá)和定位沒有發(fā)生明顯的改變;2.Akt特異性抑制劑API-2和MK2206對小鼠1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育具有明顯的抑制作用,呈劑量依賴性。一定濃度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使體外培養(yǎng)的1-細(xì)胞胚出現(xiàn)“2-細(xì)胞阻滯”現(xiàn)象;3.2.0μM API-2和30μM MK2206阻滯的2-細(xì)胞胚內(nèi),p-Ser473-Akt在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)發(fā)生了明顯的下調(diào),而pan-Akt的定位與表達(dá)并沒有產(chǎn)生明顯的變化;4.2.0μM API-2誘導(dǎo)阻滯的2-細(xì)胞胚內(nèi),Mu ERV-L和e IF-1A的m RNA水平明顯低于KSOM對照組(P0.05),而其他基因的m RNA水平與KSOM組比較,沒有明顯差別(P0.05)。5.2.0μM API-2誘導(dǎo)阻滯的2-細(xì)胞胚內(nèi),干細(xì)胞因子Oct4的m RNA水平明顯低于KSOM對照組(P0.05),而Sox2的m RNA水平與KSOM組比較,沒有明顯差別(P0.05)。結(jié)論:Akt主要活性形式p-Ser473-Akt在小鼠1-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚內(nèi)定位存在動態(tài)變化,其在1-細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚期間核內(nèi)出現(xiàn)的時間與ZGA發(fā)生的時相(minor ZGA和major ZGA)基本一致,提示p-Ser473-Akt可能參與ZGA過程。Akt特異性抑制劑API-2和MK2206對小鼠1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育具有明顯的抑制作用,一定濃度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使體外培養(yǎng)的1-細(xì)胞胚出現(xiàn)“2-細(xì)胞阻滯”現(xiàn)象,同時,也使2-細(xì)胞胚核內(nèi)p-Ser473-Akt表達(dá)水平下降。且一定濃度的API-2(2.0μM)使2-細(xì)胞胚內(nèi)ZGA標(biāo)志基因Mu ERV-L和e IF-1A,以及干細(xì)胞因子Oct4的m RNA水平明顯下調(diào)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實,Akt特異性抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的“2-細(xì)胞阻滯”,以及ZGA啟動失敗和干細(xì)胞因子Oct4表達(dá)下調(diào)與其降低核內(nèi)p-Ser473-Akt表達(dá)水平有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：p-Ser473-Akt 小鼠植入前胚 2-細(xì)胞阻滯 合子基因組激活
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R321
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-23
• 1. 材料13-18
• 1.1 實驗動物13
• 1.2 主要實驗儀器、試劑和耗材13-15
• 1.3 Akt特異性抑制劑配制15
• 1.4 免疫熒光染色相關(guān)試劑配制15-16
• 1.5 引物設(shè)計、合成、保存與配制16-17
• 1.6 RT-PCR相關(guān)試劑配制17-18
• 2. 方法18-23
• 2.1 小鼠植入前胚（1-細(xì)胞胚至 4-細(xì)胞胚）的收集18
• 2.2 小鼠 1-細(xì)胞胚的體外培養(yǎng)18-19
• 2.3 免疫熒光實驗操作步驟19-20
• 2.4.Real-Time實驗操作步驟20-23
• 2.5.統(tǒng)計學(xué)處理23
• 結(jié)果23-33
• 1. 免疫熒光染色和細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果23-29
• 1.1 p-Ser473-Akt和pan-Akt在小鼠 1-細(xì)胞胚 至 4-細(xì)胞胚階段的分布23-24
• 1.2 Akt特異性抑制劑API2和MK2206對體外小鼠植入前胚發(fā)育的影響24-29
• 1.2.1 API-2 對小鼠 1-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響24-27
• 1.2.2 MK2206對小鼠 1-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響27-29
• 1.3 API-2 和MK2206對體外發(fā)育 2-細(xì)胞胚內(nèi)p-Ser473-Akt和pan-Akt定位與表達(dá)的影響29
• 2. Real-Time PCR結(jié)果29-33
• 2.1 內(nèi)參基因H2afz，四個ZGA標(biāo)志基因和干細(xì)胞因子Oct4、Sox2的擴(kuò)增和溶解曲線29-31
• 2.2 API-2 對體外培養(yǎng)小鼠 2-細(xì)胞胚內(nèi)ZGA標(biāo)志基因的影響31-32
• 2.3 API-2 對體外培養(yǎng)小鼠 2-細(xì)胞胚內(nèi)干細(xì)胞因子Oct4和Sox2的m RNA表達(dá)水平的影響32-33
• 討論33-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-44
• 綜述44-53
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 致謝53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王喜宏;和協(xié)超;韓樹標(biāo);季維智;鄭萍;;PTEN在小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中的功能研究[J];動物學(xué)研究;2011年06期

2 邵根寶;高愛民;徐銀學(xué);丁紅梅;賈超;劉紅林;;小鼠植入前胚胎MuERV-L基因表達(dá)特征研究[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2007年04期

3 金鷹,郭小昭,李莉,謝傳昀,譚麗玲;自分泌生長因子對早期胚胎體外發(fā)育的影響(簡報)[J];實驗生物學(xué)報;2001年01期

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本文編號：789887