本文關(guān)鍵詞：RNA解旋酶Rig-I對(duì)巨噬細(xì)胞的影響及作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Rig-I 巨噬細(xì)胞 天然免疫 Rig-I 細(xì)胞因子 TLR4信號(hào)通路

【摘要】：第一部分Rig-I對(duì)巨噬細(xì)胞的數(shù)量及凋亡的影響RIG-I(retinoic acid-inducible gene-I)最初是在全反式維甲酸(all trans-retinoic acid,ATRA)誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)細(xì)胞系NB4分化過程中被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)的基因。目前普遍認(rèn)為,Rig-I是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)病原模式識(shí)別受體的一種,通過特異性識(shí)別外源RNA在宿主抗病毒先天免疫功能中發(fā)揮重要作用。在病毒感染情況下,Rig-I通過其RD結(jié)構(gòu)域識(shí)別相應(yīng)病毒RNA,與下游信號(hào)分子IPS-1(Interferon-beta promoter stimulator 1,MAVS/Cafrdif/VISA)發(fā)生相互作用,從而激活下游的IRF3(IFN regulatory factor 3)和NF-κB信號(hào)通路,產(chǎn)生I型干擾素和炎癥因子,抵抗病毒入侵。但在我們以往的研究中,意外發(fā)現(xiàn)Rig-I基因缺失小鼠的抗細(xì)菌免疫能力低下,易發(fā)生條件性致病菌感染。Rig-I基因剔除純合子小鼠由于B細(xì)胞分化缺陷和免疫球蛋白轉(zhuǎn)換受阻導(dǎo)致眼部及頸部皮膚易發(fā)生條件性致病菌-木糖型葡萄球菌(S.xylosus)感染。另外Rig-I基因剔除小鼠容易發(fā)生結(jié)腸炎、T細(xì)胞活化缺陷和粒細(xì)胞的過度增殖。這說明Rig-I在抗病毒以外,在細(xì)菌免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。另外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Rig-I可以通過調(diào)節(jié)GTP酶家族Rac/Cdc42的活性來影響細(xì)胞骨架蛋白actin的重組,從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力,Rig-I基因剔除小鼠對(duì)E.coli的吞噬能力減弱。巨噬細(xì)胞是天然免疫免疫系統(tǒng)防御體系的重要一員。我們利用現(xiàn)有的Rig-I基因剔除小鼠模型,采用流式細(xì)胞術(shù)的方法,對(duì)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞總數(shù)和凋亡以及大巨噬細(xì)胞(Large peritioneal macrophages,LPM)和小巨噬細(xì)胞(Small peritoneal macrophages,SPM)的數(shù)量進(jìn)行分析。與野生型小鼠相比,Rig-I基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的總數(shù)明顯減少、凋亡增加以及腹腔巨噬細(xì)胞LPM和SPM的數(shù)量上都發(fā)生顯著減少。這說明Rig-I對(duì)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的數(shù)量起著重要調(diào)節(jié)作用,這可能與Rig-I基因敲除的小鼠易發(fā)生條件致病菌感染存在某種的聯(lián)系。第二部分Rig-I對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖、凋亡及功能的作用研究位于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是巨噬細(xì)胞的潛在激活劑。LPS通過激活TLR4啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)。本研究我們以LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞為模型,探討Rig-I基因?qū)PS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞因子分泌等生物學(xué)功能的影響及其作用機(jī)制。以不同劑量的LPS刺激Rig-I基因沉默和過表達(dá)的小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞,采用CCK8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài);采用q PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6相關(guān)基因的表達(dá)水平;利用transwell檢測(cè)巨噬細(xì)胞的遷移;對(duì)巨噬細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用進(jìn)行分析;采用Western blot方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)水平。CCK8和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Rig-I促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖并抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,q PCR結(jié)果表明Rig-I促進(jìn)巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6基因的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rig-I通過激活A(yù)KT及其下游蛋白p-38、NF-κB和Bcl-x L等抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)。因此,本研究首次證實(shí)了Rig-I可通過AKT信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖、凋亡及功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：Rig-I 巨噬細(xì)胞 天然免疫 Rig-I 細(xì)胞因子 TLR4信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• 英文摘要6-12
• 中英文縮略詞對(duì)照表12-15
• 第一部分 Rig-I對(duì)巨噬細(xì)胞的數(shù)量及凋亡的影響15-32
• 1. 引言15-17
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 2.1 主要生化與分子細(xì)胞生物學(xué)試劑17-18
• 2.2 主要溶液配方18
• 2.3 主要儀器設(shè)備18-19
• 2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.5 PCR引物設(shè)計(jì)與合成19-20
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法20-25
• 3.1 鼠尾DNA的提取20
• 3.2 Rig-I基因敲除老鼠的鑒定20-21
• 3.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取和培養(yǎng)21-22
• 3.4 腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡22
• 3.5 腹腔巨噬細(xì)胞比例的檢測(cè)22
• 3.6 腹腔巨噬細(xì)胞的分群22-23
• 3.7 RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平23-25
• 3.8 統(tǒng)計(jì)分析25
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-29
• 4.1 Rig-I基因增加腹腔巨噬細(xì)胞的比例25-26
• 4.2 Rig-I基因抑制腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡26-27
• 4.3 Rig-I基因?qū)Ω骨痪藜?xì)胞的分群發(fā)揮重要作用27-29
• 5. 討論29-31
• 6. 本部分總結(jié)31-32
• 第二部分 Rig-I對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖，凋亡及功能的作用研究32-62
• 1. 引言32-39
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料39-42
• 2.1 材料39
• 2.2 主要化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑39-40
• 2.3 主要試劑配方40
• 2.4 PCR引物設(shè)計(jì)與合成40-41
• 2.5 實(shí)驗(yàn)儀器41-42
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法42-48
• 3.1 細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)，凍存和計(jì)數(shù)42
• 3.2 質(zhì)粒提取，純化和酶切鑒定42-44
• 3.3 Rig-I基因沉默Raw264.7 細(xì)胞株構(gòu)建44
• 3.4 Rig-I高表達(dá)Raw264.7 細(xì)胞株構(gòu)建44
• 3.5 LPS處理Raw264.7 細(xì)胞株44-45
• 3.6 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（CCK8 ）檢測(cè)細(xì)胞增殖45
• 3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡45
• 3.8 qPCR檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)量45-46
• 3.9 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)46
• 3.10 細(xì)胞粘附試驗(yàn)46-47
• 3.11 Western Blot47
• 3.12 統(tǒng)計(jì)分析47-48
• 4. 結(jié)果48-58
• 4.1 Rig-I基因促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖48-49
• 4.2 Rig-I基因抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡49-50
• 4.3 Rig-I促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)50-52
• 4.4 Rig-I促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的遷移52-53
• 4.5 Rig-I促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用53-55
• 4.6 Rig-I促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的AKT磷酸化和下游NF-κB通路的激活55-58
• 5. 討論58-61
• 6. 本部分結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-71
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文71

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