本文關鍵詞：常用實驗動物與人腸道、口腔、生殖道微生物組比較

  更多相關文章： 實驗動物 腸道菌群 口腔菌群 生殖道菌群 細菌 16Sr RNA

【摘要】：研究背景微生物(Microorganism)是一類種類繁多,數量巨大且個體難以用肉眼觀察的微小生物,它們是地球生物的主要組成部分。人體內的微生物對維持機體的健康發(fā)揮著至關重要的作用,它們從生長、發(fā)育、消化、營養(yǎng)吸收、能量供應、脂肪代謝、免疫調節(jié)、藥物代謝等諸多方面影響人類健康狀況,人體微生物中超過99%為細菌,這個集體我們統(tǒng)稱為菌群。人體內的菌群大致可分為兩類：1、定居菌群：由相當固定的微生物所組成,有規(guī)律地存在于特定部位或只見于特定年齡。如果菌群有了改變,能有較強的恢復能力。2、暫居菌群：由非致病性的或潛在致病性的微生物所組成,暫時存在于皮膚或粘膜上幾小時至幾周。只要定居菌群保持正常,暫居菌群一般并不重要；但若定居菌群失常,則暫居的潛在致病性微生物即能大量增殖,并引起疾病。一般情況下,菌群與宿主存在三種關系,即：互利共生(Mutualists)、共棲(Commensals)、致病(Pathogens)。定居菌群與宿主相互依賴,彼此得益,通常表現為：一方面,宿主為定居菌群提供營養(yǎng)和生存空間,另一方面,定居菌群幫助宿主抵御外來致病源的入侵,以保持機體健康。研究者發(fā)現,與人體相關的定居菌群對人體發(fā)育、免疫功能、營養(yǎng)吸收和能量代謝有著重要的影響,一旦失衡會引起很多慢性疾病,如代謝綜合征、肥胖、糖尿病甚至癌癥等。美國微生物學教授Savage把微生態(tài)系統(tǒng)列為諸如呼吸、循環(huán)、消化系統(tǒng)等一樣的人類第十大系統(tǒng)。在醫(yī)學領域,定居人體并與人體共生的定居菌群基因組被稱為人的“第二基因組”(the other genome)。人類“第一基因組”及““第二基因組”共同決定了人體的健康與疾病的狀態(tài)。近年來16S rRNA基因測序方法的應用,使我們對人體菌群結構和組成的認識顯著提高。醫(yī)學研究離不開實驗動物,無論是美國還是中國的食品藥品監(jiān)督管理局都規(guī)定新藥研發(fā)臨床前必須經過嚙齒類動物和非嚙齒類哺乳動物的實驗�，F代的研究中對于人體菌群研究很多,美國NIH發(fā)起的“人類微生物組計劃”,從2008年到2013年,花了1.2億美元,對300個志愿者全身各部位微生物進行測序,破解了3000種微生物全基因組,初步建立了人體共生微生物參考數據庫。歐盟發(fā)起的“人類腸道宏基因組計劃”(MetaHIT,Metagenomics of the Human Intestinal Tract),8個國家14個研究機構參與,從2008年1月1日到2012年6月30日,花了2200萬歐元,確定了腸道微生物的330萬個基因。相比較而言,關于常用實驗動物菌群的研究卻鮮有報道。國內外對于腸道疾病研究常采用的實驗動物模型主要是用大小鼠來建立的,嚙齒類動物雖然有個體小,易于操作,價格便宜等優(yōu)點,但在解剖、生理和代謝等方面與人之間存在較大的差異。大實驗動物中,豬與人類在結構和功能上有很多相似之處；犬的消化系統(tǒng)發(fā)達,與人有相同的消化過程,常用于慢性消化系統(tǒng)的研究；猴的生物學特性與人極為相似,常用于腦功能研究、血液循環(huán)、呼吸生理、內分泌、生殖生理的各方面的研究�；谝陨咸攸c,研究大動物的菌群結構,為科學研究提供基礎數據十分有必要。本研究采用基于細菌16S rRNA高通量測序法,選取了幾種常用的實驗動物(西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔以及Wistar大鼠)作為研究對象,分析了它們腸道、口腔及生殖道的菌群分布結構,初步討論常用的模型動物與人有關菌群的差異和相似性,以此為人體微生態(tài)方面的醫(yī)學研究提供基礎性資料,并為在選擇研究微生態(tài)使用的模型動物時提供一些參考,期望能夠為進一步研究疾病和菌群之間的關系找到合適的動物模型�；诩毦�16S rRNA進行測序的第二代高通量測序技術,具有通量高,成本低廉的優(yōu)點,能夠顯著改善傳統(tǒng)微生物研究方法的不足,獲得比較理想的微生物群落數據,為我們研究微生物生態(tài)學奠定了良好的方法學基礎,使得我們能夠更進一步了解微生物的結構與特征。研究目的采用基于細菌16S rRNA高通量測序法,研究幾種常用實驗動物(西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠)的菌群結構以及它們各自的特點和差異性,并和正常人的數據進行比對分析,初步討論常用實驗動物與人有關菌群的差異和相似性,以此為人體微生態(tài)方面的醫(yī)學研究提供基礎性資料,并為在選擇研究微生態(tài)使用的實驗動物模型時提供一些參考。研究方法第一章腸道菌群樣品采集及數據分析采集東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司西藏小型豬、南方醫(yī)科大學實驗動物中心比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠新鮮糞便,收集于EP管中,每個品種4只(成年),雄性1只,雌性3只；共20個樣品,-20℃保存。人的腸道菌群數據由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院提供。經糞便樣品基因組DNA提取后,用細菌16S rRNA通用引物,PCR擴增樣品的16S rRNA V4區(qū)。將PCR終產物經過Illumina Hiseq 2000平臺進行PE100-bp測序后,得到高通量下的原始數據序列,高通量測序數據用BIPES (Barcoded Illumina Paired-end(PE) Sequencing)流程進行初步原始序列處理,采用分階段聚類算法Two-Stage-Clustering(TSC)將干凈序列聚類成操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs),OTU聚類過程中主要采用三種距離法：最遠距離法、最近距離法、平均距離法。對于獲得的OTUs,使用GAST(Global Alignment for Sequence Taxonomic)算法對其進行分類。用Mothur方法獲得樣品的α多樣性分析(Shannon index,PD_whole_tree,Observed OTU,Chaol, ACE),即單個樣品包含種屬數量的多少；基于Unifrac距離,采用QIIME進行主成分分析,分析p多樣性,即不同樣品之間菌群結構的比較；采用線性判別式分析效應值(Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe),Galaxy89在線工具尋找不同組別之間有統(tǒng)計學差異的菌群標志物(即Biomarker),LEfSe分析首先采用Kruskal-Wallis秩和檢驗檢測組間豐度差異顯著的種屬,然后用成組的Wilcoxon秩和檢驗對差異顯著的物種種屬進行組間差異分析,最后用LDA對數據進行降維,評估差異顯著種屬的影響力(即LDA score)。應用IBM SPSS Statistics 20軟件進行統(tǒng)計分析,基于符合正態(tài)分布的數據,采用One-Way ANOVA進行Bonferroni法兩兩比較分析,校正檢驗水準；基于不符合正態(tài)分布的數據,采用Kruskal-Wallis One-way ANOVA進行兩兩比較,校正檢驗水準。采用GraphPad prism5軟件工具對PD_whole_tree、 Shannon等作圖。第二章 口腔菌群樣本采集及數據分析用一次性棉拭子采集東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司西藏小型豬、南方醫(yī)科大學實驗動物中心比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠新鮮口腔菌群樣品,每個品種4只(成年),雄性1只,雌性3只；共20個樣品,-20℃保存。人的口腔菌群數據由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院提供。經過細菌總DNA提取后,用細菌16S rRNA通用引物,PCR擴增樣品的16S rRNA V4區(qū)。將PCR終產物經過Illumina Hiseq 2000平臺進行PE100-bp測序后,得到高通量下的原始數據序列,數據的處理方法與第一章相同。第三章 生殖道樣本采集及數據分析用一次性棉拭子采集東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司西藏小型豬、南方醫(yī)科大學實驗動物中心比格犬、獼猴生殖道菌群樣品,每個品種3只(成年),-20℃保存。人的生殖道菌群數據由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院提供。經過細菌總DNA提取后,用細菌16S rRNA通用引物,PCR擴增樣品的16S rRNA V4區(qū)。將PCR終產物經過Illumina Hiseq 2000平臺進行PE100-bp測序后,得到高通量下的原始數據序列,數據的處理方法與第一章相同。研究結果第一章 腸道菌群結構分析1、α多樣性分析中,PD_whole_tree指數,人與西藏小型豬、獼猴的差異顯著(P0.05),西藏小型豬與獼猴、比格犬、新西蘭大白兔、Wistar大鼠差異顯著(P0.05),其余物種間均無顯著差異(P0.05)；Shannon指數,人和西藏小型豬差異顯著(P0.05),西藏小型豬與比格犬、新西蘭大白兔差異顯著(P0.05),其余物種間均無顯著差異(P0.05)。2、p多樣性分析表明,比格犬的未加權UniFrac距離和人最接近,西藏小型豬的加權UniFrac距離和人的距離最近,菌群相似度最高。3、菌群結構門水平中,西藏小型豬與人的腸道菌群門結構水平最為相近。菌群結構屬水平中,人的腸道菌群中擬桿菌屬(Bacteroides)的比例最高,其次為普氏菌屬(Prevotella)、棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)、羅斯氏菌屬(Roseburia)及梭桿菌屬(Fusobacterium),占人腸道菌群的60%以上。豬、猴、鼠的腸道菌群中普氏菌屬(Prevotella)均占有較大比例,但是豬的腸道菌群主要以普氏菌屬(Prevotella)、梭桿菌屬(Fusobacterium)及密螺旋體屬(Treponema)為主；猴的腸道菌群以乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、顫桿菌克屬(Oscillibacter)為主；鼠的腸道菌群以普氏菌屬(Prevotella)、貪噬菌屬(Variovorax)為主。犬的腸道菌群以鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為主。兔的腸道菌群以擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為主。第二章口腔菌群結構分析1、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠樣品20個及人口腔樣品15個,質控后獲取了939272條干凈的16S rRNA基因序列,獲得的最低基因序列為101條,35個樣品全部納入后續(xù)分析。2、α多樣性分析表明,人、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠口腔菌群Shannon指數均無顯著差異(P0.05)。人與豬、犬、猴、兔、大鼠差異顯著(P0.05),豬與犬、猴、兔差異顯著(P0.05),其他均無顯著差異(P0.05)。3、p多樣性分析表明,未加權UniFrac距離比較中,西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠的口腔菌群的豐富度比較相近,這可能是由于實驗動物特定的生活環(huán)境造成的；相對而言,猴和豬與人的距離較為接近,表明猴和豬與人的口腔菌群菌落的相似度高于其他物種。加權UniFrac距離中,考慮到豐度的關系,猴和人距離較近,相似度較高。4、人的口腔菌群門結構水平中有五個門的細菌占主要地位,分別是：放線菌門(Actinobacteria),厚壁菌門(Firmicutes),變形菌門(Proteobacteria),擬桿菌門(Bacteroidetes)和梭桿菌門(Fusobacteria)。豬、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群門結構水平均以變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主,占50%以上,豬、猴、大鼠的門結構水平較為相似,都有放線菌門{Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)。相比較而言,豬的口腔菌群門水平更接近人。不同物種口腔菌群在屬水平上存在差異較大,五個物種都有奈瑟氏菌屬(Neisseria)、羅氏菌屬(Roseburia)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、莫拉氏菌屬(Moraxella),口腔鏈球菌屬(Streptococcus)、放線菌屬(Actinobacillus)、梭桿菌屬 (Fusobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。第三章生殖道菌群結構分析1、西藏小型豬、比格犬、獼猴樣品9個與30～50歲健康人群的樣品10個,共19個樣品質控后獲取了135191條干凈的16S rRNA基因序列,獲得的最低基因序列為1935條,19個樣品全部納入后續(xù)分析。2、a多樣性分析表明,各物種間均無統(tǒng)計學意義,說明豬、犬、猴和人的生殖道菌群無顯著差異(P0.05)。3、p多樣性分析亦表明,豬、犬、猴和人的生殖道菌群無顯著差異(P0.05)。4、人、豬、犬、猴生殖道菌群門水平均以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)為主。其中西藏小型豬與人的生殖道菌群門結構水平較為相近,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)占所有菌群門水平的90%以上,犬和猴的門結構水平較為相似,梭桿菌門(Fusobacteria)占10-20%以上。四個物種的屬水平分布大不相同。但總的看來人的生殖道菌群中含有的普雷沃菌屬(Prevotella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、厭氧球菌屬(Anaerococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)在豬、犬、猴的生殖道菌群中都有出現。研究結論：1、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠與人的腸道菌群在屬水平上存在較大差異,西藏小型豬和獼猴可能是適合做飲食結構相關的研究的模型動物,獼猴可能是適合做關節(jié)炎及與肥胖疾病相關的模型動物,比格犬可能是適合做與慢性消化系統(tǒng)疾病相關的模型動物。2、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠與人的口腔菌群結構各不相同,在菌群的豐富度和相似程度上,猴最接近人。猴可能是研究與梭桿菌門相關口腔疾病較適宜的動物模型,豬可能是與變形菌門相關口腔感染性疾病較為合適的模型動物,犬可能是研究與螺旋體門相關的慢性牙周病較為合適的模型動物。3、西藏小型豬、比格犬、獼猴生殖道菌群與人從菌群豐富度和多樣性上均無顯著差異,猴可能是研究與普氏菌屬相關的陰道感染性疾病較為合適的模型動物,豬可能是研究與鏈球菌或不動桿菌相關的細菌性陰道炎較為合適的模型動物,犬可能是研究與乳酸桿菌屬相關疾病的模型動物。
【關鍵詞】：實驗動物 腸道菌群 口腔菌群 生殖道菌群 細菌 16Sr RNA
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R37
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 前言20-25
• 第二章 常用實驗動物與人腸道菌群比較25-38
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 試劑與耗材25
• 2.1.2 儀器25-26
• 2.2 方法26-30
• 2.2.1 樣品采集26
• 2.2.2 糞便樣品基因組DNA提取26-27
• 2.2.3 細菌16S rRNA V4區(qū)域擴增27-28
• 2.2.4 Illumina solexa測序28-29
• 2.2.5 數據分析29-30
• 2.3 結果30-36
• 2.3.1 測序與質量控制30
• 2.3.2 常用實驗動物與人腸道菌群之比較30-36
• 2.4 討論36-37
• 2.5 小結37-38
• 第三章 常用實驗動物與人口腔菌群比較38-50
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 試劑與耗材38
• 3.1.2 儀器38-39
• 3.2 方法39-42
• 3.2.1 樣本采集39
• 3.2.2 細菌總DNA提取39-41
• 3.2.3 16S rRNA基因擴增41-42
• 3.2.4 Illumina solexa測序42
• 3.2.5 數據分析42
• 3.3 結果42-48
• 3.3.1 測序與質量控制42-43
• 3.3.2 實驗動物與人口腔菌群結構比較43-48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結49-50
• 第四章 常用實驗動物與人生殖道菌群比較50-60
• 4.1 材料50-51
• 4.1.1 試劑與耗材50
• 4.1.2 儀器50-51
• 4.2 方法51-54
• 4.2.1 樣本采集51
• 4.2.2 細菌總DNA提取51-53
• 4.2.3 16S rRNA基因擴增53-54
• 4.2.4 數據分析(同2.2.5)54
• 4.3 結果54-58
• 4.3.1 測序與質量控制54
• 4.3.2 常用實驗動物與人生殖道菌群比較54-58
• 4.4 討論58-59
• 4.5 小結59-60
• 全文小結60-61
• 參考文獻61-67
• 附錄67-70
• 致謝70-71

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本文編號：640464