本文關(guān)鍵詞：14型肺炎球菌莢膜多糖純化工藝的建立與優(yōu)化

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【摘要】：肺炎球菌(Streptococcus Pneumoniae,SP),簡(jiǎn)稱肺炎球菌,是一種具有莢膜的革蘭氏陽性菌,是導(dǎo)致全球人類發(fā)病和死亡的主要致病菌之一,主要引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎以及敗血癥等疾病。目前已有利用其保護(hù)性抗原—肺炎球菌莢膜多糖(PnPS)制備的23價(jià)肺炎球菌莢膜多糖疫苗和7價(jià)、13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗上市,以防御肺炎球菌對(duì)成人和嬰幼兒造成的感染。論文以14型肺炎球菌為實(shí)驗(yàn)材料,采用常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢定方法對(duì)其進(jìn)行了篩選,挑出生物學(xué)特性典型、莢膜結(jié)構(gòu)完整豐厚、與14型分型診斷血清凝集作用較強(qiáng)的31601-5菌株建立發(fā)酵的工作種子庫(kù);以細(xì)菌生長(zhǎng)菌密度、莢膜多糖產(chǎn)率等指標(biāo)為依據(jù),通過細(xì)菌發(fā)酵罐培養(yǎng),對(duì)其適宜培養(yǎng)基成分、菌液接種量以及通氣方式等條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化。結(jié)果表明,以添加了天冬氨酸和谷氨酰胺的氨基酸培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在培養(yǎng)溫度為37℃,菌種接種量為10%、培養(yǎng)基pH值7.2、CO2 2 L/min及壓縮空氣3 L/min共同通氣培養(yǎng)的條件下,14型肺炎球菌生長(zhǎng)較好,菌密度達(dá)13.068,莢膜多糖產(chǎn)率可達(dá)到0.4 g/L。其次,對(duì)14型肺炎球菌培養(yǎng)液的裂解工藝進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證,通過觀察裂解濃度、裂解時(shí)間、裂解溫度對(duì)裂解效果的影響,最終確立了14型肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)液的裂解工藝為:細(xì)菌光密度OD600值≤12時(shí),細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)束后,于培養(yǎng)液中加入脫氧膽酸鈉,使其終濃度為0.12%,置于18~22℃環(huán)境下靜置12~18h。然后,將裂解液分別用乙醇分級(jí)沉淀法和CTAB沉淀法進(jìn)行純化,并檢測(cè)氨基己糖含量、蛋白質(zhì)含量、核酸含量及免疫雙擴(kuò)散法確定抗原活性,全面評(píng)價(jià)各種方法的純化效果,結(jié)果表明,乙醇分級(jí)沉淀法更適于14型肺炎球菌粗多糖的純化。最后,對(duì)裂解液中的粗多糖分別用脫氧膽酸鈉法和苯酚抽提法進(jìn)行處理后超濾、干燥。收獲凍干后的莢膜多糖,經(jīng)全面分析后,確定14型肺炎球菌粗多糖的去蛋白質(zhì)工藝為脫氧膽酸鈉法。工藝參數(shù)為:加入脫氧膽酸鈉,終濃度0.5%,調(diào)pH至5.0以下,離心取上清液,經(jīng)100Kd膜堆超濾后冷凍干燥收獲液。論文還應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)14型肺炎球菌莢膜多糖的超濾工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)實(shí)際操作情況及經(jīng)驗(yàn)選取跨膜壓力、切向流量和多糖濃度作為自變量,以膜包處理能力作為響應(yīng)值,先進(jìn)行單因素試驗(yàn),考察跨膜壓力、切向流量、多糖濃度對(duì)膜包處理能力的影響,并初步確定曲線的拐點(diǎn)和試驗(yàn)步長(zhǎng),再以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),利用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合,采用Design Expert軟件分析數(shù)據(jù),確定最佳超濾工藝參數(shù)為:跨膜壓力12.8Psi、切向流量66L/h、多糖濃度0.86g/L;最適透析倍數(shù)為5倍。本實(shí)驗(yàn)最終建立了一種穩(wěn)定、可適用于大規(guī)模生產(chǎn)需求的14型肺炎球菌莢膜多糖純化方法。
【關(guān)鍵詞】：肺炎球菌 培養(yǎng) 莢膜 多糖 純化
【學(xué)位授予單位】：蘭州理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.1
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 縮略詞9-10
• 第1章 引言10-14
• 1.1 課題意義及國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀綜述10-12
• 1.1.1 肺炎球菌簡(jiǎn)介10-11
• 1.1.2 肺炎球菌莢膜多糖疫苗11
• 1.1.3 23價(jià)肺炎球菌莢膜多糖疫苗研發(fā)的意義11-12
• 1.2 課題研究目標(biāo)和研究?jī)?nèi)容12-14
• 1.2.1 現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的缺陷12
• 1.2.2 課題研究目標(biāo)12
• 1.2.3 課題研究?jī)?nèi)容12-14
• 第2章 14型肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝的建立14-24
• 2.1 材料與方法14-16
• 2.1.1 材料和儀器14-15
• 2.1.2 方法15-16
• 2.2 結(jié)果與分析16-22
• 2.2.1 工作種子株的挑選結(jié)果16
• 2.2.2 14型肺炎球菌培養(yǎng)條件的摸索16-22
• 2.3 討論22-24
• 第3章 14型肺炎球菌發(fā)酵液裂解工藝的建立24-30
• 3.1 材料與方法24-25
• 3.1.1 材料和儀器24
• 3.1.2 方法24-25
• 3.2 結(jié)果與分析25-29
• 3.2.1 鏡檢法25-28
• 3.2.2 培養(yǎng)法28-29
• 3.3 結(jié)論29-30
• 第4章 14型肺炎球菌莢膜多糖粗提工藝的建立30-47
• 4.1 材料與方法30-32
• 4.1.1 材料和儀器30
• 4.1.2 方法30-32
• 4.2 結(jié)果與分析32-45
• 4.2.1 純化預(yù)處理——離心、超濾32-33
• 4.2.2 乙醇分級(jí)沉淀法工藝的摸索和建立33-38
• 4.2.3 CTAB沉淀法對(duì)14型肺炎球菌莢膜多糖的粗提取38-41
• 4.2.4 兩種方法提取效果的比較41-45
• 4.3 討論45-47
• 第5章 14型肺炎球菌莢膜多糖去蛋白工藝的建立47-53
• 5.1 材料與方法47-48
• 5.1.1 材料和儀器47
• 5.1.2 方法47-48
• 5.2 結(jié)果與分析48-51
• 5.2.1 兩種去除蛋白方法對(duì)純化多糖收獲量及組分的影響48
• 5.2.2 兩種去除蛋白方法對(duì)純化多糖分子量的影響48-49
• 5.2.3 兩種去除蛋白方法對(duì)純化多糖抗原活性的影響49-50
• 5.2.4 兩種去除蛋白方法對(duì)純化多糖結(jié)構(gòu)的影響50-51
• 5.3 討論51-53
• 第6章 14型肺炎球菌莢膜多糖超濾、干燥工藝的建立53-62
• 6.1 材料與方法53-54
• 6.1.1 材料和儀器53
• 6.1.2 方法53-54
• 6.2 結(jié)果與分析54-61
• 6.2.1 膜包截留分子量的選擇54
• 6.2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果54-56
• 6.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)56-59
• 6.2.4 超濾終點(diǎn)的確定59-61
• 6.3 討論61-62
• 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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2 陳炯;劉恩梅;;肺炎鏈球菌疫苗研究進(jìn)展[J];兒科藥學(xué)雜志;2007年04期

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4 王輝;;細(xì)菌耐藥發(fā)展的新動(dòng)態(tài)[J];傳染病信息;2004年01期

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本文編號(hào)：630470