本文關(guān)鍵詞：鸚鵡熱衣原體持續(xù)性感染經(jīng)Bcl-2家族蛋白和ERK抑制HeLa細(xì)胞凋亡

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【摘要】：背景與目的:細(xì)胞凋亡是機體清除病原微生物感染的重要防御機制。本課題組的前期研究表明鸚鵡熱衣原體(Cps)感染HeLa細(xì)胞后,可通過抑制其凋亡而發(fā)揮持續(xù)性感染,但其機制尚不明確,本研究旨在觀察人重組干擾素-γ(rh IFN-γ)誘導(dǎo)Cps 6BC持續(xù)感染條件下,觀察其對HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,從而初步闡明Cps持續(xù)性感染對凋亡的調(diào)節(jié)機制。方法:體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞,加入MOI為2的Cps 6BC菌株和35ng/m L rh IFN-γ誘導(dǎo)持續(xù)性感染,分別于感染后0、4、8、12、24h收集細(xì)胞進(jìn)行Hochest33258和TUNEL熒光染色觀察HeLa細(xì)胞凋亡情況;采用間接免疫熒光染色實驗(IFA)檢測核形態(tài)以及細(xì)胞色素c(Cyt.C)和線粒體膜電位(MMP)的變化,同時采用Western blot檢測Cps持續(xù)性感染對HeLa細(xì)胞中Fas、Fas-L、Caspase 8、Caspase 3、Cyt.C、t Bid、Bad、Bim、Mcl-1表達(dá)水平及ERK磷酸化的影響。結(jié)果:(1)Cps 6BC持續(xù)性感染HeLa細(xì)胞0、4、8、12、24h,Hochest33258和TUNEL染色結(jié)果顯示其凋亡率明顯降低,但感染24h后凋亡率有所增高但仍低于對照水平;(2)而Cps持續(xù)性感染20h后能顯著抑制STS對HeLa凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng),形態(tài)學(xué)上Cps持續(xù)感染的細(xì)胞核與正常HeLa細(xì)胞核大小、形態(tài)無明顯差異;(3)Cps持續(xù)感染4h后Caspase 3表達(dá)逐漸增加,而其活性形式(Cleaved Caspase3)隨著時間的延長而逐漸降低;(4)未感染細(xì)胞Mcl-1和Bad表達(dá)較低。Cps持續(xù)性感染4h后,Mcl-1逐漸增加,并持續(xù)至24h。而Cps持續(xù)性感染4h后,胞內(nèi)Bad表達(dá)明顯增高,但在4~24h內(nèi)呈恒定表達(dá);(5)Cps持續(xù)感染4h后,可顯著抑制CCCP誘導(dǎo)HeLa釋放Cyt.C,并持續(xù)至24h;此外,Cps持續(xù)性感染后也能一定程度削弱CCCP對MMP的影響;(6)隨著Cps持續(xù)性感染時間的延長,HeLa細(xì)胞Bim EL水平隨之降低,Bims表達(dá)增高。同時細(xì)胞內(nèi)t Bid、Cyt.C的表達(dá)水平也隨著感染時間的延長而逐漸減少;(7)隨持續(xù)性感染時間的延長,HeLa細(xì)胞內(nèi)Fas及其配體Fas-L的表達(dá)水平逐漸減少。細(xì)胞內(nèi)Caspase 8,其活性形式Cleaved Caspase 8含量也隨持續(xù)性感染時間延長而降低;(8)Cps持續(xù)性感染4~24h,磷酸化ERK水平隨著感染時間的增加而增高,并能增強STS處理后ERK的磷酸化水平結(jié)論:Cps 6BC持續(xù)性感染通過影響B(tài)cl-2家族蛋白Mcl-1、t Bid和Bim表達(dá)以及ERK磷酸化,最終調(diào)控Cyt.C釋放和細(xì)胞MMP而抑制HeLa細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：鸚鵡熱衣原體 持續(xù)性感染 抑制細(xì)胞凋亡 人重組干擾素-γ
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R374.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 主要縮略中英文縮寫索引9-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 實驗材料17-21
• 1 主要實驗器材17-18
• 2 鸚鵡熱衣原體Cps 6BC標(biāo)準(zhǔn)株18
• 3 細(xì)胞株18
• 4 主要試劑18-19
• 5 主要抗體19
• 6 溶液配制19-20
• 7 其他20-21
• 第三章 實驗方法21-31
• 1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存21
• 2 Cps的培養(yǎng)和包涵體形成單位計數(shù)21-23
• 3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及Cps持續(xù)性感染23
• 4 Hochest 33258 及TUNEL染色23-24
• 5 間接免疫熒光法檢測Cyt.C24-25
• 6 間接免疫熒光法檢測線粒體膜電位25
• 7 Western Blot檢測Mcl-1、Bad、t Bid、Bim、Cyt.C、ERK蛋白表達(dá)25-29
• 8 統(tǒng)計學(xué)分析29-31
• 第四章 實驗結(jié)果31-43
• 1 Cps持續(xù)性感染抑制HeLa細(xì)胞凋亡31-32
• 2 Cps持續(xù)性感染抑制凋亡誘導(dǎo)劑的促凋亡效應(yīng)32-33
• 3 Cps持續(xù)性感染通過抑制Caspase 3 表達(dá)抑制細(xì)胞細(xì)胞凋亡33-34
• 4 Cps持續(xù)性感染上調(diào)Mcl-1 和Bad表達(dá)34-35
• 5 Cps持續(xù)性感染經(jīng)線粒體途徑抑制HeLa細(xì)胞凋亡35-38
• 6 Cps持續(xù)性感染下調(diào)HeLa細(xì)胞內(nèi)t Bid和Bim和線粒體Cyt.C表達(dá)38-39
• 7 Cps持續(xù)性感染下調(diào)Fas和Caspase 8 表達(dá)39
• 8 Cps持續(xù)性感染通過調(diào)控ERK抑制宿主細(xì)胞凋亡作用39-43
• 第五章 討論43-47
• 第六章 結(jié)論47-49
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 綜述 衣原體抗宿主細(xì)胞凋亡調(diào)控機制研究進(jìn)展57-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要研究成果65-67
• 資助本論文試驗的課題項目和平臺67-69
• 致謝69

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本文編號：618319