本文關(guān)鍵詞：鸚鵡熱衣原體質(zhì)粒蛋白CPSIT_p8抗感染免疫保護作用

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【摘要】：目的:探究鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci,Cps)質(zhì)粒蛋白CPSIT_p8抗感染保護作用,為研制抗Cps感染的亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:從Gen Bank中獲取CPSIT_p8基因的完整序列,設(shè)計特異性引物。以菌株Cps 6BC基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴增構(gòu)建pET-30a-CPSIT_p8原核重組表達載體,最后轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coli BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、Ni-NTA親和層析法純化,收集重組蛋白,BCA法測定蛋白濃度,采用Western blotting分析和鑒定。經(jīng)腹腔途徑將CPSIT_p8重組蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,采用間接ELISA法檢測免疫小鼠血清中重組蛋白多克隆抗體的效價。以制備的多克隆抗體為一抗,運用間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析CPSIT_p8質(zhì)粒蛋白在感染細胞中的定位情況。小鼠末次免疫2周后,取脾細胞進行培養(yǎng),ELISA雙抗體夾心法檢測小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中的IL-4、IFN-γ細胞因子水平;同時,經(jīng)5.0×105 IFUs Cps6BC呼吸道感染BALB/c小鼠,觀察小鼠發(fā)病情況、體重、生存率等一般指標(biāo)的動態(tài)變化;在感染10天后,處死小鼠,取肺組織進行培養(yǎng),計數(shù)各組衣原體包涵體滴度;并采用ELISA法檢測肺組織勻漿上清中細胞因子水平;取肺組織進行HE染色和S-P免疫組織化學(xué)染色,比較CPSIT_p8蛋白免疫組與對照組小鼠肺組織的病變程度;以評估CPSIT_p8蛋白免疫保護作用。同時,進行小鼠體內(nèi)中和試驗和Cps的體外中和試驗,于感染10天后,取肺組織進行培養(yǎng),計數(shù)各組衣原體包涵體滴度;以評估小鼠血清中CPSIT_p8特異性抗體的中和能力。結(jié)果:1.構(gòu)建的原核重組表達載體pET-30a-CPSIT_p8,經(jīng)PCR和測序鑒定,測序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一樣;SDS-PAGE分析表明,在IPTG誘導(dǎo)下,CPSIT_p8重組蛋白在菌體內(nèi)能以可溶性狀態(tài)表達,且該蛋白相對分子量(Mr)與預(yù)測的分子量相近。表達產(chǎn)物采用Ni-NTA親和層析法純化后,經(jīng)Western blotting鑒定,證實該重組蛋白的存在。2.將重組蛋白經(jīng)腹腔途徑免疫三次6~8周的雌性BALB/c小鼠后,小鼠血清中總Ig G抗體效價高達1:1024000。3.在Cps感染He La細胞36h后,采用IFA法分析CPSIT_p8質(zhì)粒蛋白在感染細胞中的定位,通過激光共聚焦顯微鏡觀察到CPSIT_p8質(zhì)粒蛋白定位于包涵體內(nèi)。4.ELISA法檢測各組小鼠脾細胞上清中的細胞因子,結(jié)果表明CPSIT_p8蛋白免疫組(1734.54±21.48pg/m L)IFN-γ含量明顯高于佐劑組(195.35±3.22pg/m L)和PBS組(168.91±17.74pg/m L)(P0.001);而各組IL-4水平都很低(P0.05)。5.CPSIT_p8蛋白免疫組小鼠經(jīng)Cps呼吸道鼻滴感染10d后,取肺組織進行培養(yǎng),包涵體數(shù)量低于對照組(P0.05),ELISA法檢測肺組織勻漿上清中細胞因子水平,CPSIT_p8蛋白免疫組的IFN-γ水平明顯低于對照組(P0.001),肺組織經(jīng)HE染色和S-P免疫組織化學(xué)染色,觀察分析CPSIT_p8蛋白免疫組肺部組織病理改變明顯比對照組輕;同時,免疫組織化學(xué)染色肺組織,結(jié)果顯示免疫組衣原體棕黃色顆粒明顯比對照組少。6.小鼠體內(nèi)中和試驗和Cps的體外中和試驗,經(jīng)Cps呼吸道感染10天后,取肺組織進行培養(yǎng),結(jié)果顯示,CPSIT_p8蛋白免疫組和對照組包涵體數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:CPSIT_p8重組蛋白可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生高水平的Th1型細胞免疫應(yīng)答,對BALB/c小鼠抗Cps感染具有良好的免疫保護作用。
【關(guān)鍵詞】：鸚鵡熱衣原體 CPSIT_p8 質(zhì)粒蛋白 免疫應(yīng)答 免疫保護作用
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 主要縮略詞對照索引13-15
• 第1章 前言15-19
• 第2章 實驗材料19-23
• 2.1 主要儀器設(shè)備19-20
• 2.2 菌株和細胞株20
• 2.3 主要試劑20-23
• 第3章 實驗方法23-39
• 3.1 原核表達載體pET-30a/CPSIT_p8的構(gòu)建及鑒定23-27
• 3.2 CPSIT_p8重組蛋白在E. coli BL21中的誘導(dǎo)表達及鑒定27-29
• 3.3 CPSIT_p8重組蛋白免疫原性的檢測29-30
• 3.4 IFA法分析目的蛋白在感染細胞中的定位30-32
• 3.5 CPSIT_p8蛋白的免疫保護作用32-37
• 3.6 小鼠體內(nèi)中和試驗和Cps的體外中和試驗37
• 3.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法37-39
• 第4章 實驗結(jié)果39-51
• 4.1 目的基因PCR擴增39
• 4.2 pET-30a/CPSIT_p8重組載體的菌液PCR鑒定39-40
• 4.3 重組菌序列Blast分析40-42
• 4.4 pET-30a/CPSIT_p8重組質(zhì)粒在E. coli BL21的誘導(dǎo)表達42
• 4.5 CPSIT_p8重組蛋白的純化42-43
• 4.6 CPSIT_p8重組蛋白的Western blotting分析43
• 4.7 免疫小鼠血清的特異性抗體水平分析43-44
• 4.8 CPSIT_p8蛋白在感染細胞內(nèi)的定位44-45
• 4.9 CPSIT_p8重組蛋白免疫保護作用45-48
• 4.10 小鼠體內(nèi)中和試驗和Cps的體外中和試驗48-51
• 第5章 討論51-55
• 第6章 結(jié)論55-57
• 參考文獻57-63
• 文獻綜述63-75
• 參考文獻70-75
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果75-76
• 資助基金項目76-77
• 致謝77

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1 梁明星;鸚鵡熱衣原體質(zhì)粒蛋白CPSIT_p8抗感染免疫保護作用[D];南華大學(xué);2016年

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本文編號：545540