本文關(guān)鍵詞：表達(dá)HBsAg重組痘苗病毒小鼠免疫效果初步研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染可造成急性或慢性肝臟疾病,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)告,全球現(xiàn)有2.4億多慢性肝臟感染疾病患者,急性或慢性乙肝可導(dǎo)致每年78萬多人死亡,乙肝是全球最突出的公共衛(wèi)生問題之一。目前使用的慢性乙肝治療藥物主要有IFN、PEG-IFN-a以及核酸類似物等藥物。藥物治療只能延緩乙肝患者肝硬化進(jìn)展、降低肝癌發(fā)生率以及延長生存期,不能徹底清除患者體內(nèi)病毒,并且藥物治療存在副作用、耐藥、長期口服藥物患者依從性差等缺點(diǎn)。HBV持續(xù)感染時(shí),持續(xù)高病毒量、高HBeAg可導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭、免疫反應(yīng)受損,因而提出治療型疫苗概念,通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫,打破免疫耐受狀態(tài),從而清除病毒。病毒載體疫苗是乙肝治療型疫苗研究熱點(diǎn)方向之一。由于修飾的痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Ankara, M VA)的外源基因容量大、復(fù)制缺陷、安全性高,使其成為重組病毒疫苗的理想載體。本實(shí)驗(yàn)通過基因克隆技術(shù),構(gòu)建含有HBsAg基因的重組質(zhì)粒pSC11-S。將pSC11-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已感染MVA病毒的BHK-21細(xì)胞,質(zhì)粒和病毒基因組之間發(fā)生同源重組,通過數(shù)輪藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定目的基因,獲得攜帶HBsAg基因的重組病毒MVA-S, Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組病毒MVA-S表達(dá)乙肝表面抗原。采用不同的免疫策略,使用MVA-S和DNA-S疫苗免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾細(xì)胞,經(jīng)特異性激肽刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ,通過ELISpot實(shí)驗(yàn)檢測特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,比較各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的ELISpot結(jié)果,分析不同免疫策略產(chǎn)生的免疫效果。首先,用MVA-S和同樣表達(dá)HBsAg的兩種DNA疫苗(pVR-S、pcDNA-S)分別單獨(dú)免疫BALB/c小鼠,統(tǒng)計(jì)分析三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)對照組的ELISpot斑點(diǎn)形成細(xì)胞(Spot-forming Cells,SFC)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的ELISpot結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.61,P=0.5599),表明MVA-S、pVR-S和pcDNA-S均能刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,但它們相互之間無差異。其次,探討了異源聯(lián)合免疫效果。實(shí)驗(yàn)組小鼠采用DNA疫苗初始免疫、重組病毒MVA-S加強(qiáng)免疫,對照組小鼠DNA疫苗初始免疫后,使用MVA病毒加強(qiáng)免疫。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組和對照組的SFC差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),異源聯(lián)合免疫組SFC高于DNA單獨(dú)免疫組,證實(shí)了異源聯(lián)合免疫可引起更強(qiáng)的免疫效果。本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合免疫策略,設(shè)置了三個(gè)不同劑量的重組病毒MVA-S進(jìn)行加強(qiáng)免疫,分別為低、中、高劑量組。在2次DNA疫苗初始免疫后,使用不同劑量MVA-S免疫小鼠,結(jié)果顯示,不同劑量組之間ELISpot結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=12.67,P=0.0036),高劑量組SFC最高,表明在本實(shí)驗(yàn)劑量組范圍內(nèi),高劑量MVA-S加強(qiáng)免疫可獲得更高的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中還探究了不同DNA載體疫苗對免疫效果的影響。分別以pVR-S、 pcDNA-S兩種DNA疫苗初始免疫小鼠,采用相同MVA-S加強(qiáng)免疫,結(jié)果顯示聯(lián)合免疫中兩種DNA疫苗免疫效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明不同的DNA載體不會(huì)影響加強(qiáng)免疫效果。
【關(guān)鍵詞】：痘苗病毒安卡拉株 乙型肝炎病毒 痘病毒載體 疫苗
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 英文縮略詞表11-12
• 前言12-16
• 一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定16-22
• 1. 材料及儀器設(shè)備16-18
• 1.1 質(zhì)粒16
• 1.2 引物16
• 1.3 主要試劑16
• 1.4 主要儀器16-18
• 2. 方法18-21
• 2.1 PCR擴(kuò)增目的片段18
• 2.2 PCR產(chǎn)物回收(膠回收試劑盒)18-19
• 2.3 目的片段酶切和連接19
• 2.4 連接產(chǎn)物在E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化19
• 2.5 單克隆菌培養(yǎng)19
• 2.6 提取質(zhì)粒(質(zhì)粒小量提取試劑盒)19-20
• 2.7 重組質(zhì)粒鑒定20-21
• 3. 結(jié)果21-22
• 3.1 PCR擴(kuò)增目的片段21
• 3.2 重組質(zhì)粒pSC11-S的鑒定21-22
• 二、表達(dá)HBsAg基因的重組MVA構(gòu)建和鑒定22-30
• 1. 材料及儀器設(shè)備22-24
• 1.1 病毒、細(xì)胞和雞胚22
• 1.2 引物22
• 1.3 試劑22-23
• 1.4 主要儀器與耗材23-24
• 2. 方法24-28
• 2.1 重組MVA構(gòu)建24
• 2.2 雞胚成纖維細(xì)胞(Chick Embryo Fibroblast, CEF)制備24
• 2.3 重組病毒單個(gè)藍(lán)斑篩選24-25
• 2.4 重組病毒鑒定25-28
• 2.4.1 病毒DNA提取25-26
• 2.4.2 PCR擴(kuò)增26
• 2.4.3 Western Blot鑒定HBsAg表達(dá)26-28
• 3. 結(jié)果28-30
• 3.1 重組MVA-S篩選28
• 3.2 重組病毒MVA-S鑒定28-30
• 3.2.1 PCR鑒定28-29
• 3.2.2 Western Blot鑒定29-30
• 三、重組病毒MVA-S在小鼠體內(nèi)的免疫30-43
• 1. 材料30-32
• 1.1 小鼠免疫物30
• 1.2 主要試劑30-31
• 1.3 刺激肽序列31
• 1.4 主要儀器及耗材31
• 1.5 實(shí)驗(yàn)小鼠31-32
• 2. 方法32-39
• 2.1 免疫物準(zhǔn)備32-35
• 2.2 小鼠免疫方案35-37
• 2.3 ELISpot檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答水平37-38
• 2.4 統(tǒng)計(jì)分析38-39
• 3. 結(jié)果39-43
• 3.1 病毒滴度測定結(jié)果39
• 3.2 ELISpot檢測特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平39-43
• 討論43-45
• 總結(jié)45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 附錄50-65
• 文獻(xiàn)綜述65-78
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 作者簡介78-79
• 致謝79

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