發(fā)布時間：2017-07-04 05:11

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c的免疫活性及其診斷價值的研究

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核分枝桿菌 結(jié)核病 重組蛋白 免疫活性 血清學(xué)診斷

【摘要】：[目的]構(gòu)建含結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c基因的原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化其重組蛋白,檢測各蛋白的免疫活性,并評估其在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。[方法](1)以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA為模板,PCR分別擴(kuò)增Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c基因,將其分別亞克隆到p ET-28a以構(gòu)建成p ET-28a/Rv0220、p ET-28a/Rv2958c、p ET-28a/Rv2994和p ET-28a/Rv3347c重組載體,經(jīng)測序鑒定后,將其分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,優(yōu)化表達(dá)條件后大量表達(dá)各重組蛋白,經(jīng)Ni-NTA柱親和層析法純化各重組蛋白并經(jīng)透析復(fù)性。Western blot鑒定各重組蛋白的抗原性。BCA法測定各重組蛋白的濃度。(2)分別將純化并鑒定后的各重組蛋白經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫雌BALB/c小鼠,間接ELISA法檢測小鼠血清中Ig G、Ig G1和Ig G2a抗體水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ的濃度,CCK8法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)。(3)間接ELISA法分別檢測rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c與臨床結(jié)核病患者血清、陰性血清及肺炎支原體陽性血清的反應(yīng)情況,各份臨床血清經(jīng)結(jié)核膠體金法試劑盒(38KDa-16KDa抗原)檢測。評估各重組蛋白在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的價值。[結(jié)果](1)成功構(gòu)建了四種原核表達(dá)重組載體p ET-28a/Rv0220、p ET-28a/Rv2958c、p ET-28a/Rv2994和p ET-28a/Rv3347c,四種重組載體均以包涵體狀態(tài)表達(dá)。(2)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均具有良好的免疫原性,能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體。小鼠血清中特異性Ig G、Ig G1和Ig G2a水平隨免疫次數(shù)增加呈上升趨勢。末次免疫小鼠兩周后,各免疫組小鼠血清抗體Ig G、Ig G1和Ig G2a的均產(chǎn)生較高的抗體效價均在1:6400以上。(3)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。末次免疫后兩周,各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)SI值均明顯高于對照組(P0.01)。與對照組相比,各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞均能產(chǎn)生較高水平的IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ(P0.01)。(4)經(jīng)Western blot檢測,rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均能與結(jié)核病患者血清發(fā)生特異性反應(yīng)。間接ELISA結(jié)果表明:與結(jié)核膠體金法比較,測得rRv0220的特異度為98.6%,敏感度為98.3%,總符合率均為98.4%;rRv2985c的特異度為100.0%,敏感度為96.5%,總符合率為98.4%;rRv2994的特異度為96.5%,敏感度為100.0%,總符合率為98.4%;rRv3347c的特異度為94.7%,敏感度為98.6%,總符合率為96.9%[結(jié)論](1)成功構(gòu)建了四種原核表達(dá)載體p ET-28a/Rv0220、p ET-28a/Rv2958c、p ET-28a/Rv2994和p ET-28a/Rv3347c,表達(dá)并純化了其相應(yīng)的重組蛋白。(2)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均具有有良好的免疫原性,能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,且以Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)為主。(3)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均能與結(jié)核病患者血清發(fā)生特異結(jié)合,具有良好免疫反應(yīng)性。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 結(jié)核病 重組蛋白 免疫活性 血清學(xué)診斷
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 常用的英文縮寫10-14
• 第1章 緒論14-18
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料18-22
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)器材18
• 2.2 菌株、質(zhì)粒與試劑18-22
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法步驟22-36
• 3.1 原核重組載體的構(gòu)建及鑒定22-26
• 3.2 四種重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定26-29
• 3.3 重組蛋白的免疫活性研究29-33
• 3.4 重組蛋白免疫反應(yīng)性的臨床評價33-34
• 3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法34-36
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-48
• 4.1 四種原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定36-37
• 4.2 四種重組質(zhì)粒的表達(dá)與純化37-39
• 4.3 四種重組蛋白的免疫活性評價39-45
• 4.4 四種重組蛋白的臨床血清學(xué)檢測45-48
• 第5章 討論48-52
• 第6章 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 附錄58-64
• 文獻(xiàn)綜述64-74
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 課題資助74-76
• 研究成果及論文76-78
• 致謝78

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 段玉峰;李淼;王應(yīng)強(qiáng);劉愛青;丁紅軍;李爾春;;丹參糖蛋白提取物免疫活性研究[J];中成藥;2008年08期

2 沈建林,何曉明;香蕉多糖的免疫活性研究[J];湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報;2004年03期

3 邵紅;孫睿;童靈影;邵海軍;;野生平榛多糖對小鼠免疫活性的影響[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2010年09期

4 王宇;安貴杰;喻芳;牛莉娜;饒朗毓;裴華;;分離鑒定一株具有免疫活性的海南紅樹林真菌[J];海南醫(yī)學(xué);2010年22期

5 楊光,李肇特;交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)細(xì)胞的亮啡肽樣免疫活性定位及兒茶酚胺熒光[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1986年02期

6 趙承彥;梁克理;張靜;趙建麗;靖志安;;LAK細(xì)胞免疫活性研究[J];河南醫(yī)學(xué)研究;1993年03期

7 ;抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的特異免疫活性觀察[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;1994年06期

8 張九如,馬紅,呂曄;立春顆粒的免疫活性及安全性研究[J];中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué);2002年03期

9 林特夫,王克智,張?jiān)?蔣閨臣,馬承云,黃谷良;胸腺素免疫活性測定方法的探討[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1980年01期

10 劉慧燕;趙廣才;趙謀明;;江蘺硫酸酯多糖的體外抗腫瘤和免疫活性研究[J];現(xiàn)代食品科技;2007年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 田庚元;王晨;黃琳娟;彭雪梅;齊春會;張永祥;;枸杞子中免疫活性成分的研究[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

2 瞿文;;甘草有效成分免疫活性研究新進(jìn)展[A];全國中醫(yī)藥創(chuàng)新與發(fā)展研討會專輯[C];2005年

3 章建設(shè);雷曉凌;;魷魚內(nèi)臟糖蛋白提取工藝及其免疫活性初步研究[A];2007年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會暨水產(chǎn)微生態(tài)調(diào)控技術(shù)論壇論文摘要匯編[C];2007年

4 殷慶梅;焦玲玲;張平竹;陳華;孟明;李小六;;新型雙糖基噻唑烷-4-酮衍生物的合成及免疫活性評價[A];中國化學(xué)會第27屆學(xué)術(shù)年會第03分會場摘要集[C];2010年

5 路洪娜;趙樹立;祁曉陽;侯亞義;;SapC-DOPS促進(jìn)巨噬細(xì)胞的固有免疫活性[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

6 許軍;陳浩;彭紅;熊儉;劉燕華;;白花蛇舌草化學(xué)成分的提取和免疫活性的考察[A];2009年中國藥學(xué)大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

7 許軍;陳浩;彭紅;熊儉;劉燕華;;白花蛇舌草化學(xué)成分的提取和免疫活性的考察[A];2010年中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

8 袁仕善;吳少庭;秦莉;黃達(dá)娜;張仁利;高世同;余新炳;;SARS冠狀病毒S蛋白部分序列1的純化及免疫活性分析[A];全國新出現(xiàn)傳染病學(xué)術(shù)研討會資料匯編[C];2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李曉譽(yù);兩種蘿呮科植物的C_（21）甾體苷類成分和免疫活性研究[D];浙江大學(xué);2006年

2 李振興;蝦（Penaeus Vannamei）過敏原免疫活性的研究[D];中國海洋大學(xué);2006年

3 王魯文;高遷移率族蛋白B1在慢性乙型重型肝炎發(fā)病中的作用及對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫活性的影響[D];武漢大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄧志程;馬氏珠母貝全臟器免疫活性肽的制備及其免疫活性的研究[D];廣東海洋大學(xué);2015年

2 蔣琰;重組胱抑素C的表達(dá)及免疫活性分析[D];湖南師范大學(xué);2015年

3 趙興洪;川明參多糖的提取工藝及其免疫活性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 封燕;金蟬花多糖的結(jié)構(gòu)特征及免疫活性初步研究[D];江蘇大學(xué);2016年

5 馮婷;金針菇子實(shí)體多糖的分離純化結(jié)構(gòu)鑒定及免疫活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 王靜飛;海蜇多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及免疫活性研究[D];合肥工業(yè)大學(xué);2016年

7 游曉攏;結(jié)核分枝桿菌Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c的免疫活性及其診斷價值的研究[D];南華大學(xué);2016年

8 張奕敏;油菜蜂花粉多肽分離純化及免疫活性研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2007年

9 李艷偉;酶解血蛋白中活性肽的純化和功能研究[D];吉林大學(xué);2005年

10 蔡英姬;羊胚胎盤肽的制備及其免疫活性的研究[D];延邊大學(xué);2007年

，

本文編號：516451