本文關(guān)鍵詞：諾如病毒Sydney株P(guān)顆粒與HBGA受體的結(jié)合特性及GⅡ.4型廣譜單克隆抗體的制備

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【摘要】：研究背景和目的諾如病毒(Norovirus, NoV)是引起非細(xì)菌性胃腸炎最主要的病原體。NoV呈高傳染性,主要通過(guò)糞-口途徑傳播,也可以通過(guò)攝入被病毒污染的水和食物進(jìn)行傳播。典型的臨床癥狀表現(xiàn)為NoV感染后24～48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)嘔吐和／或伴有腹瀉,之后癥狀緩解,疾病呈自限性。NoV是引起5歲以下兒童胃腸炎的主要病毒性病原體,僅次于輪狀病毒(Rotavirus, RV)。然而,隨著輪狀病毒疫苗的研制成功并在許多國(guó)家中的推廣應(yīng)用,使得NoV迅速取代RV成為主要的病毒性病原體。大量的腸道病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明,成人中的NoV感染率呈逐年上升的趨勢(shì),在老年人和免疫缺陷的人群中,NoV還會(huì)引起慢性感染、嚴(yán)重疾病甚至死亡。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家NoV都可以引起全年齡組人群的疾病暴發(fā)。預(yù)防和控制NoV暴發(fā)流行已成為全世界共同面臨的公共衛(wèi)生問(wèn)題。NoV為單股正鏈RNA,無(wú)包膜。病毒RNA編碼3個(gè)開(kāi)放閱讀框(OpenReading Frame, ORF), ORF1、ORF2、ORF3,其中ORF2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1, VP1由兩部分組成即S區(qū)和向外凸起的P區(qū)域,并通過(guò)一段鉸鏈區(qū)連接在一起。P區(qū)域又分為P1亞區(qū)和P2亞區(qū),P2亞區(qū)為氨基酸高變區(qū),根據(jù)基因突變和X射線晶體結(jié)構(gòu)分析,P2亞區(qū)被認(rèn)為是人類組織血型抗原(Human histo-blood group antigen,HBGA)的受體結(jié)合區(qū)域。由于NoV既不能在細(xì)胞中培養(yǎng),又沒(méi)有合適的小動(dòng)物模型,所以有關(guān)病原體感染和進(jìn)化機(jī)制的研究受到限制,阻礙了預(yù)防控制感染和疾病治療的進(jìn)展。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,為深入探究NoV的致病機(jī)制提供了契機(jī)。目前NoV的VPI已通過(guò)重組的桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到表達(dá),并于體外自行組裝成不含RNA的病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP),由于VLP在結(jié)構(gòu)和抗原性方面與天然NoV相似,具有免疫原性和受體結(jié)合特性,所以可將其作為研究NoV的替代品。近年來(lái)研究者利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在體外表達(dá)NoV P區(qū)域形成P顆粒(P Particle),其免疫原性、HBGA受體的結(jié)合能力及親和力與VLP相似,因其具備表達(dá)周期短,穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),是研究NoV的替代工具,利用P顆�？梢蕴骄縉oV與HBGA受體的結(jié)合模式,明確高危易感人群,為研制高效疫苗提供物質(zhì)基礎(chǔ)。NoV具有基因多樣性,根據(jù)VP1區(qū)核苷酸序列分析,分為6個(gè)基因組(Genotypegroup,G),即GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ、GⅥ主要感染人類的基因組為GⅠ、GⅡ,分別進(jìn)一步分為9個(gè)和22個(gè)基因型。其中GⅡ.4 NoV為優(yōu)勢(shì)株,引起絕大多數(shù)NoV胃腸炎暴發(fā)流行。GⅡ.4 NoV易變異,每2-4年便會(huì)出現(xiàn)新的變異株。近期新現(xiàn)的變異株GⅡ.4 Sydney株于2012年澳大利亞檢出,替代GⅡ.4 New Orleans株成為全球流行的優(yōu)勢(shì)株,并迅速席卷全球,在美國(guó)、英國(guó)、荷蘭、日本、澳大利亞、法國(guó)及新西蘭等國(guó)家引起不同程度的急性胃腸炎感染疫情,在我國(guó)北京、上海、廣州、江蘇、湖州、荊州、香港、和臺(tái)灣等地均有Sydney株感染疫情的報(bào)道。本研究擬利用大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)制備GⅡ.4 NoⅤ Sydney株P(guān)顆粒,以期通過(guò)與唾液中HBGA受體的結(jié)合實(shí)驗(yàn),探索我國(guó)GⅡ.4 NoⅤ Sydney株的NoV-HBGA受體結(jié)合模式,從而為明確Sydney株感染的宿主范圍和制定高危人群預(yù)防策略提供基礎(chǔ)依據(jù)。擬對(duì)廣東汕尾地區(qū)體檢人群GⅡ.4 NoV Sydney株的血清抗體開(kāi)展調(diào)查,了解該人群Sydney株的流行狀況,為NoV的預(yù)防控制提供科學(xué)信息。采用多種GⅡ.4 NoV變異株聯(lián)合免疫的方式,制備具有廣譜抗GⅡ.4 NoV特性的單克隆抗體,為NoⅤP顆粒亞基疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法1.P區(qū)域目的片段的提取從NoV暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)獲得糞便樣本SH 2012—05,提取病毒RNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增P區(qū)域,測(cè)序進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)和生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。2.pGEX-4T-1-P重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將P區(qū)域片段連接到表達(dá)載體pGEX-4T-1上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP 10感受態(tài)細(xì)菌,提取重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-P進(jìn)行菌落PCR和BamHI、NoTI酶切鑒定。3.P顆粒的表達(dá)、純化及鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-P轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組蛋白GST-P particle。利用GST層析柱重力作用對(duì)GST-P particle進(jìn)行純化,通過(guò)凝血酶除去GST標(biāo)簽蛋白。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳和Westernblot分析鑒定。4.P顆粒與HBGA受體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)P顆粒與39份HBGA表型已明確的唾液樣本的結(jié)合反應(yīng),在450nm波長(zhǎng)處讀取OD值,根據(jù)陰性對(duì)照OD值的分布情況,OD450≥0.12判定為陽(yáng)性。5.廣東汕尾地區(qū)體檢人群GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗體的檢測(cè)以GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒為包被抗原,用間接ELISA法檢測(cè)調(diào)查人群血清中的GⅡ.4 NoV Sydney株抗體。酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處讀取OD值,OD450值≥0.15判斷為陽(yáng)性。6.GⅡ.4型NoV廣譜單克隆抗體的制備采用多株GII.4型NoV P顆粒聯(lián)合免疫BALB/c小鼠,按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合。間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,通過(guò)三次亞克隆得到穩(wěn)定的單克隆抗體細(xì)胞系。分別利用單克隆抗體亞類試劑盒、間接ELISA法和NoV-HBGA結(jié)合阻斷實(shí)驗(yàn)鑒定單克隆抗體的亞類、特異性和中和能力。研究結(jié)果1. GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)區(qū)域的獲取樣本SH 2012_05經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小為1000bp的P區(qū)域片段,測(cè)序結(jié)果顯示該片段與GⅡ.4 NoV Sydney/2012(登陸號(hào)：KC175323)P區(qū)域同源,同源性達(dá)到99.9%。2. pGEX-4T-1-P重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-P的菌落PCR顯示大小為1000bp的條帶；酶切結(jié)果顯示大小為4.9kb和1000bp的兩條片段,結(jié)果與預(yù)期相符,重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-P構(gòu)建成功。3. GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒的鑒定結(jié)果10%SDS-PAGE電泳得到相對(duì)分子量為36kDa的蛋白,其大小與預(yù)計(jì)P顆粒大小相符,Western blot分析顯示GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒具有抗原特異性。4. GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒與HBGA受體的結(jié)合模式GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒與A、B、AB和O型分泌型HBGA受體均能結(jié)合(OD450值均≥0.12),其中與B型HBGA受體的親和力最高：而與非分泌型HBGA受體不結(jié)合(OD450值≤0.09)。5.廣東汕尾地區(qū)體檢人群GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗體的檢測(cè)結(jié)果廣東汕尾地區(qū)體檢人群中的GⅡ.4 NoV Sydney株的血清抗體陽(yáng)性率較高為88.14%(171/194),其中男性血清抗體陽(yáng)性率為86.11%(62/72),女性為81.15%(99/122)。用X2檢驗(yàn)比較不同表型HBGA受體之間性別分布,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=14.041,P=0.0030.05)。男性調(diào)查人群中不同表型HBGA受體間GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗體陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確檢驗(yàn)值為9.289,P=0.0130.05),分泌型HBGA受體中A型和B型的抗體陽(yáng)性率最高,分別是95.00%(19/20)和95.83%(23/24)；其次是O型分泌型HBGA受體,抗體陽(yáng)性率為78.95%(15/19)；非分泌型抗體陽(yáng)性率最低,為55.56%(5/9)。女性調(diào)查人群中不同表型HBGA受體間GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗體陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確檢驗(yàn)值為11.709,P=0.0070.05),分泌型HBGA受體中B型抗體陽(yáng)性率最高,為100.00%(19/19)；其次是A型和O型分泌型HBGA受體,抗體陽(yáng)性率分別是為83.33%(20/24)和81.97%(50/61)；非分泌型抗體陽(yáng)性率最低,為55.56%(10/18)。6.GⅡ.4型NoV廣譜單克隆抗體的鑒定鏡下觀察圓形透亮的細(xì)胞呈串狀分布,即為融合的雜交瘤細(xì)胞,融合率為33.07%(127/384),融合細(xì)胞陽(yáng)性率為28.35%(36/127)。共獲得13株單克隆抗體,經(jīng)鑒定抗體亞類均屬于IgG1型,所有單抗都均能與不同GⅡ.4型NoV變異株特異性結(jié)合,其中3株單抗G7C, G2E, G4D具有明顯的受體阻斷能力。研究結(jié)論1.成功制備了具有良好抗原特異性的GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒,GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒能與A、B、O、AB型分泌型HBGA受體結(jié)合,而與非分泌型HBGA受體不結(jié)合。2.廣東汕尾地區(qū)體檢人群中的存在較高的GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗體陽(yáng)性率,分泌型HBGA受體血清抗體陽(yáng)性率高于非分泌型,提示G Ⅱ.4 NoV Sydney株在該調(diào)查人群中廣泛流行,分泌型HBGA受體人群較非分泌型人群更易感GⅡ.4 NoVSydney株。3.成功制備出對(duì)GⅡ.4型NoV具有廣譜性的單克隆抗體,具備阻斷NoV與受體結(jié)合的能力。
【關(guān)鍵詞】：諾如病毒 GⅡ.4基因型 Sydney變異株 P顆粒 人類組織血型抗原 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-24
• 第一章 GⅡ.4 NoV Sydney株P(guān)顆粒的表達(dá)及與HBGA受體的結(jié)合特性24-39
• 1.1 材料24-26
• 1.2 方法26-32
• 1.3 結(jié)果32-36
• 1.4 討論36-39
• 第二章 廣東汕尾體檢人群GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗體的調(diào)查39-46
• 2.1 材料39-40
• 2.2 方法40-41
• 2.3 結(jié)果41-44
• 2.4 討論44-46
• 第三章 GⅡ.4型NoV廣譜單克隆抗體的制備46-57
• 3.1 材料46-47
• 3.2 方法47-51
• 3.3 結(jié)果51-54
• 3.4 討論54-57
• 本研究的創(chuàng)新與不足57-58
• 全文小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-67
• 縮略語(yǔ)詞匯表67-69
• 攻讀學(xué)位期間成果69-70
• 致謝70-71

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 ;China-NSW Climate Change Forum Held in Sydney[J];Voice of Friendship;2009年02期

2 ;[J];;年期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張婷;諾如病毒Sydney株P(guān)顆粒與HBGA受體的結(jié)合特性及GⅡ.4型廣譜單克隆抗體的制備[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 蔣揚(yáng)峰;“Sydney”餐巾紙折疊機(jī)的研發(fā)[D];浙江大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：511562