本文關(guān)鍵詞：Toll樣受體-3和-4對干細(xì)胞成軟骨分化的影響及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探索Toll樣受體(Toll Like Receptor,TLR)-3和-4在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成軟骨分化的過程中對蛋白多糖和II型膠原蛋白形成的影響及機(jī)制。方法用Ficoll密度梯度離心法分離SD大鼠BMSCs,并進(jìn)行傳代擴(kuò)增。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD44、CD54、CD90的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。取活力好的第3代BMSCs作為實(shí)驗(yàn)對象,在正式分組干預(yù)前,首先以Western blot法檢測蛋白多糖和II型膠原的表達(dá),作為后續(xù)試驗(yàn)的比較基線。再將BMSCs隨機(jī)分為空白組、TLR-3激活組、TLR-4激活組,分別以PBS、TLR-3激動劑(Poly[I:C],SIGMA P9582-5MG 1μg/ml)、TLR-4激動劑(LPS,SIGMA L2630-10MG1μg/ml)處理后。三組細(xì)胞均進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。培養(yǎng)第14天,以阿利新藍(lán)染色檢測蛋白多糖的形成,以免疫熒光及Western blot法檢測II型膠原的表達(dá),以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Sox-9的表達(dá)。結(jié)果以Ficoll密度梯度離心法成功分離得到成纖維樣貼壁生長的細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)檢測表面標(biāo)志物表達(dá),結(jié)果為CD34(—)、CD44(+)、CD54(+)、CD90(+),符合BMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)特點(diǎn),證實(shí)分離培養(yǎng)所得細(xì)胞為大鼠BMSCs。分組處理前,細(xì)胞并不表達(dá)蛋白多糖及II型膠原,BMSCs在化學(xué)組成上并不表現(xiàn)出成軟骨細(xì)胞的特性。經(jīng)過2周成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng),空白組、TLR-3激活組和TLR-4激活組均生成了蛋白多糖,阿利新藍(lán)染色均為陽性,計(jì)數(shù)并比較發(fā)現(xiàn),三組間陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.628,P=0.5470.05)。免疫熒光及Western-blot結(jié)果顯示,三組均表達(dá)II型膠原,但空白組表達(dá)明顯低于TLR-3激活組和TLR-4激活組(t3=3.993,P3=0.0030.05;t4=7.650,P4=0.0000.05),而后兩組間無明顯差異(t=0.934,P=0.3720.05)。PCR結(jié)果顯示,TLR-3和TLR-4激活組Sox-9相對表達(dá)量分別是對照組Sox-9表達(dá)量的2.2倍和2.14倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t3=4.47,P3=0.000.05;t4=3.61,P4=0.020.05),而前兩組之間Sox-9的表達(dá)量無明顯差異(t=1.12,P=0.270.05)。結(jié)論經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng),大鼠BMSCs能夠形成基質(zhì)蛋白多糖及II型膠原,初步具有軟骨細(xì)胞特性。TLR-3和TLR-4對基質(zhì)蛋白多糖的形成無明顯作用,卻能夠促進(jìn)II型膠原的形成,其機(jī)制可能是TLR-3和-4對Sox-9表達(dá)的上調(diào)作用。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成軟骨分化 蛋白多糖 II型膠原
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R68
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 引言11-14
• 第二章 大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（Ficoll密度梯度離心法）、傳代培養(yǎng)及細(xì)胞表面標(biāo)志物的聯(lián)合鑒定14-24
• 1.前言14-15
• 2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>15
• 3.實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 3.1. 實(shí)驗(yàn)動物15
• 3.2. 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器15-16
• 3.3. 實(shí)驗(yàn)試劑的配置16-17
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法17-19
• 4.1. 大鼠BMSCs的分離及原代培養(yǎng)17-19
• 4.2. 細(xì)胞流式技術(shù)檢測BMSCs特異性表面標(biāo)志物19
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-21
• 5.1. 大鼠BMSCs的形態(tài)及分布19-20
• 5.2 細(xì)胞流式技術(shù)檢測 BMSCs 特異性表面標(biāo)志物20-21
• 6. 結(jié)果討論21-24
• 第三章 Toll樣受體-3 和-4 對干細(xì)胞成軟骨分化的影響和機(jī)制24-44
• 1. 前言24
• 2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>24-25
• 3.實(shí)驗(yàn)材料25-30
• 3.1. 細(xì)胞系25
• 3.2. 實(shí)驗(yàn)試劑/試劑盒25
• 3.3. 實(shí)驗(yàn)儀器及器材25-26
• 3.4.實(shí)驗(yàn)試劑的配置26-30
• 4.實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 4.1. 大鼠BMSCs細(xì)胞系的獲取30-31
• 4.2.成軟骨誘導(dǎo)前蛋白多糖和II型膠原的檢測31-32
• 4.3. 試驗(yàn)分組處理及成軟骨誘導(dǎo)32-33
• 4.4. 成軟骨誘導(dǎo)后蛋白多糖和II型膠原的檢測33
• 4.5. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Sox-9 基因33-35
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-39
• 5.1. 成軟骨誘導(dǎo)前蛋白多糖及II型膠原的表達(dá)35-36
• 5.2. 成軟骨誘導(dǎo)后蛋白多糖及II型膠原的變化36-38
• 5.3. TLRs對Sox-9 基因表達(dá)的影響38-39
• 6. 討論39-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 致謝51-53
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其它學(xué)術(shù)成果53-55
• 綜述：TLR在微生物識別到自噬中的重要作用55-73
• 參考文獻(xiàn)63-73
• 附錄：主要略縮詞一覽表73-74

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