本文關(guān)鍵詞：NIX在CCCP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體自噬調(diào)控作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的NIX是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的隸屬于Bcl-2家族中的BH3-only促凋亡蛋白,又被稱為Bcl-2/E1B 19kDa interacting protein 3-like(BLIP3L),其編碼產(chǎn)物擁有Bcl-2家族的羧基末端跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和BH3結(jié)構(gòu)域。NIX定位于線粒體外膜,能通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域和E1B19K、Bcl-X1、Bcl-2等蛋白相互作用,導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放,引起細(xì)胞凋亡。大量研究證實(shí),NIX蛋白在促進(jìn)細(xì)胞存活中也扮演了重要角色,而且越來(lái)越多的證據(jù)顯示人類多種疾病的發(fā)生與缺氧條件下NIX引起的線粒體自噬有著密切的關(guān)系。本課題我們主要在分子的水平上研究NIX對(duì)羰基氰化物間氯苯腙(carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone CCCP)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體自噬的影響來(lái)進(jìn)一步探討NIX對(duì)CCCP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體自噬的調(diào)控作用。方法1采用PCR技術(shù)構(gòu)建NIX過(guò)表達(dá)重組慢病毒載體和NIX shRNA干擾重組慢病毒載體。2采用病毒感染PC12細(xì)胞的方式構(gòu)建對(duì)照細(xì)胞株(NC)、NIX過(guò)表達(dá)細(xì)胞株、NIX shRNA干擾細(xì)胞株三種細(xì)胞模型。各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細(xì)胞后,采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NIX蛋白的表達(dá)情況,并通過(guò)免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞NIX的表達(dá)。3將對(duì)照細(xì)胞、NIX過(guò)表達(dá)細(xì)胞、NIX shRNA干擾細(xì)胞作為我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別對(duì)三組細(xì)胞使用不同濃度(0、10、20、30)μmol/l的CCCP處理6h,以及使用濃度為20μmol/l的CCCP處理不同時(shí)間(0、2、4、6)h,比較CCCP不同濃度、不同時(shí)間處理后對(duì)各組細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)和NIX蛋白表達(dá)量的影響,以及NIX過(guò)表達(dá)、NIX shRNA干擾對(duì)CCCP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體自噬的影響。結(jié)果1.nix過(guò)表達(dá)重組慢病毒載體和nixshrna重組慢病毒載體構(gòu)建成功,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。2.成功構(gòu)建對(duì)照細(xì)胞(nc)、nix過(guò)表達(dá)細(xì)胞(nix)、nix干擾細(xì)胞(nixshrna)三種細(xì)胞模型,與對(duì)照組細(xì)胞相比,nix過(guò)表達(dá)細(xì)胞中nix蛋白表達(dá)量顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與對(duì)照組細(xì)胞相比,nixshrna干擾細(xì)胞中nix蛋白表達(dá)量顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.與同組細(xì)胞對(duì)照相比,經(jīng)過(guò)cccp處理后對(duì)照組細(xì)胞、nix過(guò)表達(dá)細(xì)胞、nixshrna干擾細(xì)胞的ros均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.與對(duì)照組細(xì)胞相比,nix過(guò)表達(dá)細(xì)胞ros含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。5.與對(duì)照組細(xì)胞相比,nixshrna干擾細(xì)胞ros含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。6.與同組細(xì)胞對(duì)照相比,經(jīng)過(guò)高濃度cccp處理后,對(duì)照組細(xì)胞、nix過(guò)表達(dá)細(xì)胞nix蛋白表達(dá)量均明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。7.與同組細(xì)胞對(duì)照相比,經(jīng)過(guò)cccp處理后,對(duì)照組細(xì)胞自噬逐漸增強(qiáng),線粒體自噬逐漸減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與同組細(xì)胞對(duì)照相比,nix過(guò)表達(dá)細(xì)胞自噬逐漸增強(qiáng),線粒體自噬增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。8.與對(duì)照組細(xì)胞相比,當(dāng)cccp濃度達(dá)到30μmol/l時(shí),nix過(guò)表達(dá)細(xì)胞自噬和線粒體自噬明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。9.與同組細(xì)胞對(duì)照相比,經(jīng)過(guò)cccp處理后,nixshrna干擾細(xì)胞自噬增強(qiáng),線粒體自噬減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。10.與對(duì)照組細(xì)胞相比,經(jīng)過(guò)cccp處理后,nixshrna干擾細(xì)胞自噬和線粒體自噬顯著減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論1.CCCP促進(jìn)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。2.NIX過(guò)表達(dá)、NIX shRNA干擾抑制CCCP處理后細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。3.高濃度的CCCP促進(jìn)細(xì)胞中NIX蛋白的降解。4.NIX能促進(jìn)CCCP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：CCCP ROS 線粒體自噬 NIX PC12
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-18
• 1 實(shí)驗(yàn)材料18-22
• 1.1 主要儀器設(shè)備18
• 1.2 抗體18-19
• 1.3 主要試劑及常用試劑配方19-22
• 2 實(shí)驗(yàn)方法22-30
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)22
• 2.3 NIX慢病毒表達(dá)載體和NIX shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、包裝及滴度測(cè)定22-24
• 2.4 NIX過(guò)表達(dá)和NIX干擾細(xì)胞模型的構(gòu)建24-25
• 2.5 各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細(xì)胞中NIX蛋白的表達(dá)25-27
• 2.6 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞NIX的表達(dá)27
• 2.7 DCFH-DA探針?lè)肿訙y(cè)定各組細(xì)胞ROS的含量27-28
• 2.8 CCCP對(duì)細(xì)胞NIX蛋白表達(dá)的影響28
• 2.9 NIX過(guò)表達(dá)對(duì)CCCP誘導(dǎo)線粒體自噬的影響28-29
• 2.10 NIX干擾后對(duì)CCCP誘導(dǎo)線粒體自噬的影響29
• 2.11 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析29-30
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-40
• 3.1 慢病毒載體的測(cè)序鑒定30-31
• 3.2 各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細(xì)胞中NIX蛋白的表達(dá)情況31
• 3.3 熒光顯微鏡觀察各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細(xì)胞中NIX的表達(dá)31-32
• 3.4 各組細(xì)胞活性氧的含量32-34
• 3.5 CCCP對(duì)細(xì)胞NIX蛋白表達(dá)的影響34-35
• 3.6 NIX過(guò)表達(dá)對(duì)CCCP誘導(dǎo)的線粒體自噬的影響35-37
• 3.7 NIX干擾對(duì)CCCP誘導(dǎo)的線粒體自噬的影響37-40
• 4 討論40-44
• 5 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 文獻(xiàn)綜述51-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 附錄61-63
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果63-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Elisabetta Ceni;Tommaso Mello;Andrea Galli;;Pathogenesis of alcoholic liver disease:Role of oxidative metabolism[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期

2 Inna N Shokolenko;Glenn L Wilson;Mikhail F Alexeyev;;Aging:A mitochondrial DNA perspective,critical analysis and an update[J];World Journal of Experimental Medicine;2014年04期

  本文關(guān)鍵詞：NIX在CCCP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體自噬調(diào)控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：490344