本文關(guān)鍵詞：普通棉耳狨猴MHC-I限制性等位基因抗原分子特征分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：普通棉耳狨猴屬新世界小型靈長類動物,與絹毛猴同屬狨科,原產(chǎn)于中美洲北部。狨猴由于體小、易于管理、繁殖率較高、費用低、易在實驗室內(nèi)籠養(yǎng)等優(yōu)點,自七十年代起被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)多學(xué)科領(lǐng)域的研究,如人類腦發(fā)育、內(nèi)分泌學(xué)、行為學(xué)、免疫學(xué)、畸胎學(xué)、病毒學(xué)、病毒腫瘤學(xué)和生殖生物學(xué)等。先前研究表明,GBV-B可以感染普通棉耳狨猴,引起它們類似人類病毒性肝炎的癥狀。而HCV與GBV-B很近似,同屬黃病毒科肝病毒屬。故本課題組提出科學(xué)假設(shè)：以HCV的基因替換GBV-B相應(yīng)基因構(gòu)建嵌合病毒是否也能感染狨猴?針對此假設(shè),本課題組以HCV1b的完整囊膜蛋白(HCV-E1E2p7)和HCV完整結(jié)構(gòu)蛋白(HCV-CE1E2p7)置換GBV-B的相應(yīng)功能區(qū)構(gòu)建了兩種嵌合病毒HCV-CE1E2p7/GBV-B、HCV-E1E2p7/GBV-B,實驗證明兩種病毒均能夠感染狨猴,病毒均能在肝細胞內(nèi)進行復(fù)制及表達并能釋放到外周血中,嵌合病毒感染的狨猴可產(chǎn)生針對HCV病毒的特異性免疫反應(yīng),為我們提供了一個新型的用于研究HCV病毒與宿主相互作用、研發(fā)HCV疫苗及抗HCV藥物的能夠替代黑猩猩的小型動物模型,建立的嵌合病毒狨猴感染模型能夠更準確真實地模擬HCV在靈長類動物體內(nèi)的活動狀態(tài)。然而在此實驗中,不同的個體感染病毒后雖都可以造成持續(xù)感染,但是不同個體的病毒載量、持續(xù)時間、肝臟損傷程度都有所不同。而在檢測狨猴針對HCV的T細胞免疫反應(yīng)實驗時中也證實不同個體對同一表位多肽T細胞免疫反應(yīng)不同。這應(yīng)該與不同個體的免疫反應(yīng)有關(guān)。而主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(MHC-I)抗原分子的多態(tài)性決定了狨猴針對病毒的特異性細胞免疫反應(yīng)的抗原限制性。隨機挑選的遺傳背景未知的狨猴感染HCV可能造成個體間的免疫應(yīng)答有所不同。如果狨猴間具有相同的MHC-I等位基因,可能提呈相同的抗原肽,引起的免疫反應(yīng)也會類似。故實驗可挑選MHC-I類等位基因相同的狨猴進行同一實驗保證實驗的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。但在人類和鼠、恒河猴等實驗動物的MHC-I分子研究已經(jīng)相當(dāng)深入的同時,狨猴的MHC-I類分子研究才剛剛起步。因此,揭示狨猴MHC-I類等位基因及其抗原分子的特性,有助于后續(xù)挑選狨猴作為實驗動物時保證實驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性,豐富狨猴MHC-I類分子遺傳背景信息,為后續(xù)了解狨猴對HCV特異性細胞免疫保護反應(yīng)的分子機制和疫苗免疫研究提供重要信息。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是由一群緊密連鎖的基因群組成,定位于動物和人類染色體的特定區(qū)域,呈現(xiàn)復(fù)雜的多態(tài)性,且所有的基因均為共顯性表達。MHC分子是參與免疫細胞發(fā)育、抗原提呈和識別以及免疫應(yīng)答的關(guān)鍵成分。在病毒感染細胞后合成的病毒蛋白、腫瘤細胞合成的腫瘤抗原以及胞內(nèi)某些正常成分等內(nèi)源性抗原所引起的T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中,MHC-Ⅰ類分子與抗原肽結(jié)合成復(fù)合物,經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運至細胞表面,提呈給CD8+T細胞。由于不同MHC-I類等位基因產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)各異,使不同個體對特定抗原的應(yīng)答能力存在差異。因此清晰的MHC-I類分子遺傳背景對病毒感染后個體特異性細胞反應(yīng)和腫瘤疾病機體應(yīng)答的研究具有重要作用。普通棉耳狨猴作為實驗動物模型,清晰的MHC遺傳背景資料對于其在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用有較大的輔助作用。但到目前為止,對普通棉耳狨猴MHC的研究還很有限。本研究從3只用來研究HCV/GBV-B感染模型的普通棉耳狨猴中克隆、分離出了MHC-I類等位基因分子全長重鏈和輕鏈p2m的mRNA基因,對已確定的12只狨猴MHC-I類等位基因序列進行了詳細的分析,并挑選了在狨猴中的優(yōu)勢MHC-I類等位基因進行表達,同時分析了MHC輕鏈β2m的序列,闡明了狨猴MHC-I類蛋白的結(jié)構(gòu)特征,并嘗試制備了狨猴MHC-I/肽可溶性單體。此研究豐富了狨猴MHC-I類分子遺傳背景,為狨猴模型更好的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。如后續(xù)增大樣本量,我們期望發(fā)現(xiàn)大部分狨猴共有的等位基因,構(gòu)建MHC-I四聚體對狨猴HCV感染模型中機體產(chǎn)生的抗原特異性T細胞進行深入的研究。目的：此研究旨在揭示普通棉耳狨猴MHC-I類和β2m基因的特征,闡明狨猴MHC-I類蛋白的結(jié)構(gòu)特征,豐富狨猴的MHC-I類分子背景資料,提高后續(xù)挑選狨猴作為實驗動物時的穩(wěn)定性和重復(fù)性,為后續(xù)了解狨猴對HCV特異性細胞免疫保護反應(yīng)的分子機制和疫苗免疫研究提供重要信息。方法：1：研究對象普通棉耳狨猴common marmosets (Callithrix jacchus)3只,雄性,體重300-400g左右/只。2：實驗方法(1)普通棉耳狨猴MHC-I重鏈蛋白分子制備：采用RT-PCR技術(shù)從狨猴PBMC中擴增MHC-I類等位基因全長,根據(jù)單倍型克隆數(shù)≥2的原則,確定能編碼完整蛋白的MHC-I類等位基因。利用DNAMAN5.2.2軟件對等位基因的序列進行綜合比對,并將等位基因的堿基序列翻譯為氨基酸序列后比對,利用MEGA4.1軟件制作系統(tǒng)進化樹進行狨猴等位基因分析。挑選出現(xiàn)頻率最高的等位基因,并在其羧基端加上BSP基因后插入原核表達載體中進行表達,SDS-PAGE、WB鑒定表達情況。鎳柱純化。(2)普通棉耳狨猴MHC-I鏈β2-microglobulin蛋白分子制備：采用RT-PCR技術(shù)從狨猴PBMC中擴增β2m的mRNA基因。用DNAMAN和DNAstar軟件對序列進行分析,并與其他靈長類動物及不同物種的β2m進行同源性比對、系統(tǒng)進化分析。亞克隆β2m成熟肽基因,插入原核表達載體pET-28a(+)中,并通過SDS-PAGE和WB鑒定其表達。鎳柱純化。(3)普通棉耳狨猴MHC-I-BSP和β 2m成熟肽結(jié)構(gòu)分析及可溶性單體制備和鑒定：運用BioEdit和DNAstar對MHC-I-BSP蛋白以及p2m成熟肽蛋白一級結(jié)構(gòu)進行分析,Protscale程序進行蛋白疏水性分析,ANTHEPROT程序進行蛋白質(zhì)理化特性分析,NetPHos2.0 Server進行蛋白質(zhì)磷酸化位點分析。用圓二色譜、SOPMA和PredictProtein軟件對蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。利用SWISS-MODEL程序?qū)Φ鞍走M行同源建模分析。采用Altman首創(chuàng)的四聚體制備方法嘗試了狨猴MHC-I/肽可溶性單體的制備。結(jié)果：(1) MHC-I重鏈蛋白分子制備從3只普通棉耳狨猴PBMC中克隆的MHC-I類等位基因擴增產(chǎn)物全長為1100bp左右,共得到了116個MHC-I等位基因克隆,根據(jù)單倍型克隆數(shù)≥2的原則,從中確定了7個能編碼為完整蛋白的Caja-G等位基因和1個假基因。新確定的MHC-I類等位基因均被劃分為Caja-G型等位基因。將序列翻譯為氨基酸序列后與人的HLA-G進行比對,可見Caja-G等位基因序列呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。狨猴MHC-I類等位基因序列包含胞外段(α1-a3),跨膜段和胞內(nèi)段,胞外段。遠膜端αl、α2結(jié)構(gòu)域其氨基酸排列順序變化較大,共同構(gòu)成了抗原結(jié)合槽,是Ⅰ類分子多態(tài)性的基礎(chǔ)。近膜端的α3結(jié)構(gòu)域氨基酸序列較為保守。挑取了加上之前本課題組研究的總共12只狨猴中出現(xiàn)頻率最高的等位基因Caja-G*09:03作為需要表達的蛋白. Caja-G*09:03攜帶率相對較高,預(yù)期Caja-G*09:03構(gòu)建的四聚體具有較好的可行性和應(yīng)用前景。并通過PCR技術(shù)將BirA酶底物肽(BSP)基因連接到了Caja-G*09:03胞外域的羧基端,Caja-G*09:03胞外域-BSP插入原核表達載體pET-28a(+)中,鑒定其表達后進行了條件優(yōu)化使其大量表達。Caja-G*09:03-BSP(MHC-I-BSP)蛋白分子大小約34kDa。包涵體洗滌溶解后,SDS-PAGE結(jié)果顯示包涵體純度較純。由于缺乏針對狨猴Caja-G的單克隆抗體,此處采用針對His標(biāo)簽的抗體檢測蛋白表達。Western Blot顯示蛋白大小與SDS-PAGE一致。并用鎳柱對蛋白進行了純化。(2) MHC-I輕鏈(β2-microglobulin蛋白分子制備克隆的β2m的mRNA基因全長為357bp,前20個氨基酸為信號肽部分,后99個氨基酸為成熟肽部分,與GenBank中普通棉耳狨猴β2m的mRNA序列(XM一002753411.2)同源性為100%,證明了其高度保守性。亞克隆了p2m基因的成熟肽部分,將β2m基因的成熟肽基因插入原核表達載體pET-28a(+)中進行蛋白表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白大小約為12kDa,與理論預(yù)測值一致。采用針對狨猴β2m的單克隆抗體和His標(biāo)簽抗體對蛋白進行了鑒定,分子大小一致,說明β2m正確表達。用鎳柱對蛋白進行了純化。(3)蛋白結(jié)構(gòu)分析及可溶性單體制備和鑒定普通棉耳狨猴MHC-I-BSP蛋白(Caja-G*09:03-BSP)和β2m成熟肽蛋白預(yù)測分子量分別為33.63KDa和11.60KDa。與之前原核表達的結(jié)果一致。其理論假設(shè)的等電點pI分別為5.085和7.355。MHC-I-BSP蛋白疏水性為1.389,β2m成熟肽蛋白疏水性為1.122。棉耳狨猴MHC-I-BSP蛋白存在著21個潛在的磷酸化位點,β2m蛋白8個潛在的磷酸化位點。SOPMA預(yù)測的MHC-I-BSP蛋白以α-螺旋、p-折疊和隨機卷曲為主。PredictProtein預(yù)測的MHC-I-BSP蛋白α-螺旋占據(jù)22.3%,p-折疊為32.6%,其他結(jié)構(gòu)為45%。β2m成熟肽蛋白SOPMA預(yù)測的蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以p-折疊和隨機卷曲為主,其中最主要的結(jié)構(gòu)元件為β-折疊,占43.43%,α-螺旋最少,僅4.04%。PredictProtein預(yù)測的結(jié)果與SOPMA結(jié)果基本一致,其不含α-螺旋,β-折疊比例為45.5%。圓二色譜儀(JASCO J-810)測定CD值與軟件預(yù)測存在較大的差異。蛋白同源建模分析顯示狨猴MHC-I-BSP蛋白的3D結(jié)構(gòu)與人的HLAⅠ的3D結(jié)構(gòu)相似,由2個反向平行的α螺旋和8個p片層組成,具有一個抗原結(jié)合槽。a3由7條p片層組成。β2m蛋白的3D結(jié)果與人的β2m蛋白的3D結(jié)構(gòu)類似,由7個p片層組成,無α螺旋。采用Altman首創(chuàng)的四聚體制備方法嘗試了狨猴MHC-I/肽可溶性單體的制備,為進一步制備MHC-I/肽四聚體做準備。選取前期實驗狨猴T細胞反應(yīng)檢測中具有強反應(yīng)性的HCV E1 (El-282)和已報道的人HLA-A2優(yōu)勢表位肽NS3(CV9)構(gòu)建Caja-G*09:03限制性的MHC-I/肽可溶性單體,但折疊后復(fù)合物經(jīng)HPLC和ELISA鑒定后未發(fā)現(xiàn)有單體形成,在優(yōu)化反應(yīng)條件及改變濃縮方式、純化方法后均未發(fā)現(xiàn)單體形成。對此結(jié)果進行了分析。結(jié)論：(1)利用RT-PCR技術(shù)從3只普通棉耳狨猴PBMC中擴增了MHC-I類等位基因重鏈和β2m基因,并對加上之前本課題組研究的總共12只狨猴的MHC-I類等位基因序列進行了詳細的分析,豐富了狨猴MHC-I類等位基因遺傳背景。(2)亞克隆了Caja-G*09:03胞外域和β2m成熟肽基因,在Caja-G*09:03胞外域羧基端連接上了BSP基因,使其羧基端可以成功標(biāo)記上生物素,為下一步構(gòu)建狨猴的MHC四聚體研究奠定了基礎(chǔ)。(3)將狨猴Caja-G*09:03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽基因連接至pET-28a(+)原核表達系統(tǒng),進行了原核表達并對其表達條件進行了優(yōu)化,蛋白以包涵體的形式進行了高效表達。并用鎳柱進行了純化。(4)運用測序所得基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列和生物信息學(xué)軟件、圓二色譜(CD)對狨猴Caja-G*09:03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)進行分析,并運用同源建模構(gòu)建了狨猴Caja-G*09:03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽蛋白的三級結(jié)構(gòu)(3D)模型。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析為狨猴HCV/GBV-B嵌合病毒模型CD8+T細胞免疫反應(yīng)的研究提供了遺傳背景和重要信息。(5)采用Altman首創(chuàng)的且是目前最常用于MHC-I/肽四聚體制備的技術(shù)對普通棉耳狨猴Caja-G*09:03限制性的MHC-I/肽四聚體制備進行了嘗試。雖經(jīng)HPLC和ELISA鑒定無單體形成,但本實驗對未形成單體原因進行了分析,并為后續(xù)的實驗提供了清晰的方向。
【關(guān)鍵詞】：普通棉耳狨猴 MHC-Ⅰ類分子β2m 蛋白表達 結(jié)構(gòu)分析 可溶性單體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-33
• 第1章 普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ重鏈蛋白分子制備33-66
• 1.1 材料33-38
• 1.2 方法38-50
• 1.3 結(jié)果50-62
• 1.4 討論62-66
• 第2章 普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ輕鏈β2-microglobulin蛋白分子制備66-78
• 2.1 材料66
• 2.2 方法66-68
• 2.3 結(jié)果68-76
• 2.4 討論76-78
• 第3章 普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP和β2m成熟肽結(jié)構(gòu)分析及可溶性單體制備和鑒定78-94
• 3.1 材料78-79
• 3.2 方法79-82
• 3.3 結(jié)果82-90
• 3.4 討論90-94
• 全文總結(jié)94-95
• 參考文獻95-101
• 攻讀學(xué)位期間成果101-102
• 致謝102-103

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 胡蘇瑋;鐘燕芳;吳菁;麥明琴;周才;江瑋;;胎兒血清β_2微球蛋白水平與宮內(nèi)病毒感染的關(guān)系[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2013年05期

  本文關(guān)鍵詞：普通棉耳狨猴MHC-I限制性等位基因抗原分子特征分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：489036