本文關鍵詞：ATP7A調控小鼠神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅是哺乳動物體內必不可少的微量元素之一,具有氧化還原化學性質,對機體的代謝過程有重要的作用。同時,銅作為含銅酶和含銅蛋白質的重要組成部分,參與哺乳動物體內細胞呼吸、自由基清除、色素形成、結締組織形成、神經(jīng)肽加工和鐵運輸?shù)�。ATP7A是調節(jié)銅穩(wěn)態(tài)的關鍵蛋白,還參與把銅傳遞給含銅酶和含銅蛋白,其基因突變導致的疾病,如門克斯病(MD),可以有效證明其作用的重要性。ATP7A功能的障礙往往伴隨著神經(jīng)退行,目前研究顯示ATP7A受神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的時空調控,可能參與神經(jīng)元的發(fā)育。為了研究ATP7A在神經(jīng)元發(fā)育中的調控作用,本試驗以C57BL/6小鼠為研究對象,分析了體外培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)干細胞(NSC)、星形膠質細胞和海馬神經(jīng)元中ATP7A的表達水平。并且利用多功能誘導干細胞——小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)向神經(jīng)元定向分化的方法,研究了MEF敲除Atp7a后向神經(jīng)元分化的細胞形態(tài)學差異,結果如下:1.從C57BL/6小鼠胚胎和新生乳鼠中分別分離出了神經(jīng)干細胞(NSC)、星形膠質細胞和海馬神經(jīng)元,并通過細胞免疫熒光染色對其進行鑒定,其純度均達到90%以上。2.分離了E13.5-14.5小鼠胚胎成纖維細胞(MEF),通過細胞免疫熒光染色分析了MEF和以上三種細胞中ATP7A的細胞定位,顯示熒光信號均位于細胞核和質膜之間。3.通過real-time QPCR和Western blot比較了這四種細胞中ATP7A的mRNA及其表達水平,發(fā)現(xiàn)ATP7A在MEF、NSC、星形膠質細胞和海馬神經(jīng)元中表達量依次是顯著減少的,說明ATP7A的表達隨神經(jīng)發(fā)育過程可能下降,并且證明利用MEF向神經(jīng)元轉分化研究ATP7A調控神經(jīng)元發(fā)育的方案是可行的。4.利用分離到的基因型為Atp7afl/Y的胚胎成纖維細胞(MEF7a+),通過感染Cre重組腺病毒敲除Atp7a,獲得MEF7a+·Cre+/-,并用real-time QPCR和Western blot驗證了其敲除效率約70%。5.進行重組腺病毒Ascl1,Brn2和Ngn2(ABN)誘導MEF7a+和MEF7a+·Cre+/-(ABN+MEF7a+和ABN+MEF7a+·Cre+/-),以及重組腺病毒Cre和ABN共同處理MEF7a+(ABNC+MEF7a+),向神經(jīng)元的定向分化試驗。分化7d和12d后,進行β-Tubulin III免疫熒光染色,對分化出的神經(jīng)元進行形態(tài)上的分析和統(tǒng)計分析,計算胞體面積、神經(jīng)纖維總長、最長神經(jīng)纖維長度、從胞體發(fā)出的纖維數(shù)量、神經(jīng)纖維分支數(shù)量。分化7 d后,實驗組與對照組細胞形態(tài)無明顯差別,陽性細胞胞體呈圓形、橢圓形和三角形,大多從胞體伸出細長突起。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)分化7 d時,ABN+MEF7a+·Cre+/-胞體體積較其他兩組較小(*p0.05),與對照組相比,其他兩組中,細胞從胞體發(fā)出較少且較短的神經(jīng)纖維(***p0.001,**p0.01),也具有較少分支(***p0.001);分化12 d時,ABN+MEF7a+·Cre+/-和ABNC+MEF7a+胞體體積無差別,其他與分化7 d時相似。綜上所述,本試驗從體外細胞水平證明ATP7A影響體外神經(jīng)元神經(jīng)纖維的發(fā)育,敲除Atp7a后,細胞突起少且短,分支也較少。本試驗為研究ATP7A調節(jié)神經(jīng)元發(fā)育的作用提供了重要依據(jù),為研究ATP7A突變引起的神經(jīng)退行性疾病的機理提供了一定的基礎。
【關鍵詞】：神經(jīng)元分化 ATP7A 轉分化 原代培養(yǎng)
【學位授予單位】：安徽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R338
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 縮略語表11-12
• 1 文獻綜述12-20
• 1.1 銅的營養(yǎng)概述12-13
• 1.2 銅的體內平衡13-14
• 1.3 銅的細胞內平衡14
• 1.4 銅轉運P型ATPases——ATP7A/ATP7B14-15
• 1.5 銅與神經(jīng)退行性疾病15-16
• 1.6 ATP7A與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育16-20
• 2 引言20-21
• 3 材料與方法21-34
• 3.1 材料21-23
• 3.1.1 實驗動物21
• 3.1.2 試劑21-22
• 3.1.3 主要儀器與耗材22-23
• 3.2 試劑的配置23
• 3.3 實驗方法23-34
• 3.3.1 小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)23-24
• 3.3.2 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)24
• 3.3.3 星形膠質細胞的培養(yǎng)24-25
• 3.3.4 神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)25
• 3.3.5 Ascl1/Brn2/Ngn2/Cre腺病毒的獲得25-26
• 3.3.6 病毒滴度的測定26
• 3.3.7 Atp7afl/Y小鼠胚胎成纖維細胞Atp7a的敲除26-27
• 3.3.8 小鼠胚胎成纖維細胞轉分化為神經(jīng)元27-28
• 3.3.9 細胞的免疫熒光染色28
• 3.3.10 胚胎和新生小鼠基因型的鑒定28-29
• 3.3.11 Atp7a mRNA在細胞中的表達29-31
• 3.3.12 蛋白質免疫印跡31-33
• 3.3.13 作圖與分析軟件33-34
• 4 結果與分析34-49
• 4.1 原代細胞的分離與鑒定34-38
• 4.1.1 MEF的分離34-35
• 4.1.2 NSC的分離鑒定35-36
• 4.1.3 神經(jīng)元的分離與鑒定36-37
• 4.1.4 星形膠質細胞的分離與鑒定37-38
• 4.2 四種細胞ATP7A的定位及表達量的分析38-40
• 4.2.1 ATP7A在四種細胞中的定位38-39
• 4.2.2 ATP7A在四種細胞中的表達39-40
• 4.3 病毒滴度的測定40-41
• 4.4 MEF7a+?Cre+細胞的獲得41-43
• 4.4.1 MEF7a+細胞的獲得41
• 4.4.2 MEF7a+細胞中Atp7a的敲除41-43
• 4.5 MEF7a+和MEF7a+?Cre+轉分化差異43-49
• 4.5.1 三種處理中神經(jīng)元胞體的體積的比較44-45
• 4.5.2 三種處理中從神經(jīng)元胞體發(fā)出的神經(jīng)突起數(shù)目比較45-46
• 4.5.3 三種處理中神經(jīng)元神經(jīng)纖維分支數(shù)目比較46-47
• 4.5.4 三種處理中神經(jīng)元總神經(jīng)纖維長度比較47-49
• 5 討論49-53
• 5.1 原代細胞的分離49-50
• 5.2 ATP7A在神經(jīng)干細胞的分化前后表達量下降50
• 5.3 ATP7A位于MEF和神經(jīng)細胞的細胞核和質膜之間50
• 5.4 MEF向神經(jīng)元轉分化的方法50
• 5.5 轉分化中涉及的轉錄因子和添加劑50-51
• 5.6 ATP7A不影響神經(jīng)發(fā)生的過程和胞體的大小51-52
• 5.7 ATP7A影響神經(jīng)元神經(jīng)纖維的發(fā)育52
• 5.8 本試驗的不足之處和展望52-53
• 6 結論53-54
• 參考文獻54-61
• 致謝61-62
• 作者簡介62
• 碩士期間發(fā)表的論文62

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7 李U，

本文編號：476538