本文關鍵詞：健脾益肺方治療ALS動物模型hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的療效和機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：肌萎縮側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一類主要累及運動神經(jīng)元的進展性神經(jīng)變性病,目前尚無有效的治療方法。本研究擬通過不同濃度的健脾益肺方治療ALS的動物模型hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,通過檢測模型小鼠的運動功能和脊髓前角運動神經(jīng)元的存活情況來評價健脾益肺方的療效,檢測脊髓的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性來評價健脾益肺方的抗氧化自由基作用。為中藥組方治療ALS動物模型的療效及作用機制提供初步的實驗依據(jù)。方法：一、試劑和設備(一)健脾益肺方組成：黃芪9g,黨參4.5g,白術4.5g,茯苓1g,麥冬3g,陳皮0.5g,法夏0.5g,杏仁1g,射干1g,石菖蒲0.5g,白附子0.5g,僵蠶0.5g,制馬錢子0.1g,炙甘草2g。全部購買無糖顆粒劑型,批號：YPA2L0002,購自江陰天江藥業(yè)有限公司。(二)MDA.GSH.SOD和GSH-Px的檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；焦油紫購自Sigma-Aldrich公司,其他普通試劑為國產(chǎn)分析純。二、實驗動物及分組(一)hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠購買自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院。(二)動物分組：應用8周齡的hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠共24只,按數(shù)字編號隨機分為四組,每組6只。(1)生理鹽水組(2)低濃度健脾益肺方組(2.86g／Kg)(3)中濃度健脾益肺方組(5.72g／Kg)(4)高濃度健脾益肺方組(11.44g／Kg),選同窩8周的普通野生型小鼠共6只為正常對照組,灌注生理鹽水。觀察小鼠的運動功能及生存期,終末期時分別取各組實驗鼠各3只,進行脊髓前角運動神經(jīng)元的尼氏染色,另每組3只進行抗氧化自由基實驗。三、具體實驗步驟(一)健脾益肺組方治療后模型小鼠的體重變化每日實驗前采用電子秤稱量模型小鼠的體重,并做好記錄。(二)健脾益肺組方治療后模型小鼠發(fā)病時間、生存期及運動功能的評估1.發(fā)病時間(每日評定)采用Weydt 4分法進行評定：4分：沒有運動功能異常；3分：懸尾時出現(xiàn)后肢顫抖；2分：步態(tài)異常；1分：至少1個后肢出現(xiàn)拖曳；0分：將鼠翻身成仰臥位30s內(nèi)無法翻回俯臥位。發(fā)病評價：回顧性分析(超過2周),以Weydt＜4分的初始時間作為發(fā)病開始。2.生存期死亡時間：將鼠翻身為仰臥位30s內(nèi)無法翻回俯臥位即Weydt為0分,登記為死亡。3.運動功能(1)懸尾實驗：懸提鼠尾,觀測后肢的伸張及其曲腰情況,并予評分。2分：正常；1分：部分正常；0分：缺失。(2)牽引實驗：將小鼠放于30公分長的鐵絲上,小鼠5分鐘內(nèi)掉落的次數(shù)(小鼠掉落后,立刻將其放置鐵絲上繼續(xù)實驗)。(3)跑臺實驗：將小鼠放在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上,以轉(zhuǎn)速16圈／分鐘連續(xù)5分鐘,登記每組小鼠的平均掉棒次數(shù)(小鼠掉棒后,立即將其放置回疲勞轉(zhuǎn)棒儀上繼續(xù)實驗)。(三)健脾益肺組方治療后的病理改變應用4%的多聚甲醛經(jīng)心臟灌注,后固定24小時,蔗糖梯度脫水,用OCT包埋,取脊髓的腰段進行冰凍切片(切片厚度20μm),每隔3片取1片。應用焦油紫進行尼氏染色。前角運動神經(jīng)元的計數(shù)標準：具有清晰可辨的尼氏結構,清晰的細胞核和核仁,胞體較大的多角細胞。(四)健脾益肺組方治療機制的探討抗氧化自由基：硫代巴比妥酸法檢測MDA的含量；亞硝酸鹽法測定SOD的活性；二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH的含量；二硝基苯甲酸法測定GSH-Px的活性,按照試劑盒說明書操作。結果：1.體重的變化8周齡模型小鼠開始進行體重測定,第8-12周各組間的體重無顯著性差異,至第12周開始,生理鹽水組模型小鼠體重開始減輕,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重仍緩慢增加；第13周開始,低濃度、中濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重也開始下降,而高濃度組模型小鼠體重仍在緩慢增加；約15周開始,高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重開始下降,同生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重下降趨勢較慢,且呈濃度正相關性。低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異不具有統(tǒng)計學意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)。2.對發(fā)病時間和生存期的影響生理鹽水組的模型小鼠在(101.5±3.45)天出現(xiàn)臨床癥狀,即Weydt 4分法,評分4分時(為發(fā)病時間),模型小鼠在病程中會出現(xiàn)后肢無力,懸尾時后肢震顫、后伸乏力的表現(xiàn),至終末期時雙側后肢呈牽直樣強直、背部屈曲,終因飲食艱難、呼吸無力而死亡,平均存活時間為(133.2±2.32)天。低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠的發(fā)病時間分別為(103.3±2.16)天、(109.5±1.87)天、(112±3.03)天,低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異無統(tǒng)計學意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較差異具有統(tǒng)計學意義。低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠的生存期分別為(134.3±1.86)天, (140.2±2.32)天,(147.8±1.17)天,低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異無統(tǒng)計學意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠較生理鹽水組模型小鼠的生存時間延長,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)。3.運動功能：牽引實驗：同一時期不同濃度健脾益肺方治療組模型小鼠的墜落次數(shù)并不一樣,健脾益肺方治療組的模型小鼠較生理鹽水組模型小鼠明顯耐受性好,且呈濃度正相關性,低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異無統(tǒng)計學意義；中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠同生理鹽水組模型小鼠比較差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p＜0.01)跑臺實驗：同期中,健脾益肺方治療組的模型小鼠較生理鹽水組模型小鼠墜落明顯減少,同樣呈濃度正相關性：低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠同生理鹽水組模型小鼠比較差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.脊髓前角運動神經(jīng)元的計數(shù)隨著鼠齡的增長,模型小鼠的腰段脊髓前角病變的神經(jīng)元會逐步出現(xiàn)尼氏體不清、變性,核固縮,細胞體積減小,細胞萎縮,數(shù)量減少,整個脊髓前角外形萎縮,病變隨時間延長而進行性加重。終末期取生理鹽水組、陰性對照組、低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組病理切片尼氏染色。生理鹽水治療組運動神經(jīng)元計數(shù)為(3.86±1.215)個／視野,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組分別為(4.00±0.816)個/視野, (4.57±0.976)個/視野, (7.57±0.976)個/視野,陰性對照組運動神經(jīng)元計數(shù)為(9.82±0.216)個/視野。低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,無統(tǒng)計學意義；中濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)；高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)；陰性對照組小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)5.谷胱甘肽(GSH)的含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GH-Px)的活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)的含量生理鹽水組模型小鼠的GSH、GSH-PX、SOD值最低,MDA值最高；陰性對照組小鼠的GSH、GSH-PX、SOD值最高,MDA值最低。健脾益肺方組模型小鼠的GSH、GSH-PX、 SOD值隨著濃度的增高而增高,MDA值隨著濃度增高而減低。低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,不具有統(tǒng)計學意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠相比,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；陰性對照組小鼠與生理鹽水組模型小鼠相比,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.01)。結論：中濃度、高濃度健脾益肺方延緩hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的體重下降,延緩hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病時間,增加hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠存活天數(shù),改善hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的運動功能,可能是通過中濃度、高濃度健脾益肺方提高抗氧化能力,降低氧化自由基損傷,達到了保護神經(jīng)細胞目的,延緩了神經(jīng)細胞的凋亡過程,從而使疾病的進展變得緩慢。本研究采用ALS的經(jīng)典模型hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠進行中藥的療效及機制研究,為中藥治療ALS提供了動物模型研究依據(jù)。應用不同濃度的健脾益肺方治療ALS,對健脾益肺方的作用機制進行了初步探討,為健脾益肺方治療ALS提供了初步的動物實驗依據(jù)。
【關鍵詞】：健脾益肺方 肌萎縮側索硬化 SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R277.7;R-332
【目錄】：

• 摘要3-7
• Abstract7-14
• 引言14-16
• 第一章 研究背景16-26
• 第一節(jié) 肌萎縮側索硬化的西醫(yī)研究現(xiàn)狀16-19
• 一、ALS的流行病學特點16
• 二、ALS的病因和發(fā)病機制16-17
• 三、SOD1突變基因與ALS17-18
• 四、氧化應激與ALS18
• 五、ALS的治療18-19
• 第二節(jié) 肌萎縮側索硬化的中醫(yī)研究現(xiàn)狀19-22
• 一、ALS的中醫(yī)病名19-20
• 二、ALS的中醫(yī)病因病機20
• 三、ALS的中醫(yī)治療20-21
• 四、健脾益肺方在臨床中的運用21-22
• 第三節(jié) 健脾益肺方的中醫(yī)方解及現(xiàn)代藥理22-25
• 一、中醫(yī)方解22
• 二、方中組成的藥理22-25
• 第四節(jié) ALS的動物模型25
• 第五節(jié) 研究目的和意義25-26
• 第二章 實驗研究26-43
• 第一節(jié) 實驗試劑與材料26-27
• 一、實驗動物26
• 二、主要試劑26-27
• 三、主要儀器27
• 第二節(jié) 試劑的配制27-30
• 一、中藥組方的配制27-28
• 二、普通試劑配制28
• 三、SOD、MDA、GSH、GSH-PX試劑盒配制28-30
• 第三節(jié) 實驗具體操作30-33
• 一、動物分組與給藥30
• 二、體重變化30
• 三、發(fā)病時間及生存期觀察30
• 四、運動功能30-31
• 五、組織學方法31-33
• 六、統(tǒng)計學處理33
• 第四節(jié) 實驗結果33-43
• 一、體重變化33-34
• 二、發(fā)病時間及生存期觀察34
• 三、運動情況34
• 四、脊髓前角細胞34-35
• 五、抗氧化自由基35-43
• 討論43-49
• 結語49-50
• 參考文獻50-52
• 附錄52-53
• 在校期間發(fā)表論文情況53-54
• 致謝54-55
• 附件55

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  本文關鍵詞：健脾益肺方治療ALS動物模型hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的療效和機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：451199