發(fā)布時間：2017-06-13 20:06

  本文關鍵詞：LOC401296分子相互作用蛋白的篩選和鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的采用酵母雙雜交系統(tǒng),尋找與LOC401296存在相互作用的蛋白,通過對相互作用蛋白的分析,以進一步了解LOC401296的功能。方法1采用酵母雙雜交的方法篩選LOC401296的相互作用蛋白。首先構建p DBLeu-loc融合表達載體,再將p DBLeu-loc轉入Ma V203酵母菌株,并進行毒性和自激活檢測;然后篩選成人肝c DNA文庫,進行陽性克隆三報告基因表型鑒定;最后陽性克隆回轉驗證,排除假陽性克隆。生物信息學分析篩選到的陽性克隆。2采用細胞免疫熒光方法聯(lián)合激光共聚焦技術觀察LOC401296與相互作用蛋白在HEK293細胞中的共定位。結果1通過酵母雙雜交技術篩選出了LOC401296相互作用蛋白。成功構建p DBLeu-loc融合表達載體,并對篩選到的陽性克隆回轉驗證。將得到的陽性基因進行生物信息學分析共得到8個陽性克隆。2成功構建p EGFP-GRN、p EGFPPLSCR1、p EGFP-N4BP2L2三個融合表達載體。采用細胞免疫熒光方法聯(lián)合激光共聚焦技術觀察LOC401296分別與GRN、PLSCR1、N4BP2L2在HEK293細胞中共定位情況,發(fā)現(xiàn)LOC401296與3個相互作用蛋白均存在共定位。結論1通過酵母雙雜交技術篩選LOC401296的相互作用蛋白,共篩選出8個陽性克隆,分別為GRN、PLSCR1、N4BP2L2、FN1、NOTCH3、LTBP3、ADAMTS-L4、EGFL7,這些基因各具功能,這表明了LOC401296參與的生物學過程的多樣性及其作用機制的復雜性。2通過細胞免疫熒光方法聯(lián)合激光共聚焦技術對LOC401296和GRN、PLSCR1、N4BP2L2進行了細胞內定位研究,觀察到LOC401296與GRN、PLSCR1、N4BP2L2在HEK293細胞內的表達以及良好的共定位情況,為后續(xù)研究LOC401296的功能提供了線索。
【關鍵詞】：LOC401296 酵母雙雜交技術 相互作用蛋白
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q51;R3411
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 英文縮略表9-10
• 引言10-12
• 第1章 酵母雙雜交技術篩選相互作用蛋白12-31
• 1.1 實驗材料12-17
• 1.1.1 菌株、細胞、載體12-14
• 1.1.2 主要酶制劑、試劑盒、試劑14-15
• 1.1.3 主要儀器設備15
• 1.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配制15-17
• 1.2 實驗方法17-23
• 1.2.1 PDBLeu-LOC誘餌載體的構建17-18
• 1.2.2 PDBLeu-LOC誘餌質粒轉化酵母及毒性、自激活檢測18-20
• 1.2.3 pDBLeu-loc作為誘餌篩選成人肝cDNA文庫20-23
• 1.2.4 陽性酵母菌落的鑒定23
• 1.2.5 回轉驗證23
• 1.3 結果23-30
• 1.3.1 誘餌載體pDBLeu-loc構建23-24
• 1.3.2 誘餌質粒pDBLeu-loc在MaV203酵母菌株中毒性及自激活檢測24-25
• 1.3.3 以pDBLeu-loc為誘餌篩選成人肝cDNA文庫25-27
• 1.3.4 陽性克隆質�；剞D驗證27-28
• 1.3.5 陽性克隆獵物質粒測序與分析28-29
• 1.3.6 陽性克隆文庫質粒序列編碼蛋白質的生物信息學分析29-30
• 1.4 小結30-31
• 第2章 LOC401296及相互作用蛋白的共定位31-52
• 2.1 實驗材料31-35
• 2.1.1 菌株、細胞、載體31
• 2.1.2 主要酶制劑、試劑盒、試劑31-32
• 2.1.3 主要儀器設備32-33
• 2.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配制33-35
• 2.2 實驗方法35-40
• 2.2.1 pEGFP-GRN、pEGFP-PLSCR1、pEGFP-N4BP2L2載體的構建35-37
• 2.2.2 GRN、PLSCR1、N4BP2L2的pEGFP融合質粒在HEK293細胞中表達37-39
• 2.2.3 細胞免疫熒光和激光共聚焦技術觀察三個蛋白與LOC401296共定位39-40
• 2.3 結果40-50
• 2.3.1 pEGFP-GRN、pEGFP -PLSCR1、pEGFP -N4BP2L2載體的構建40-44
• 2.3.2 Western Blot檢測pEGFP-GRN、pEGFP-PLSCR1、pEGFP-N4BP2L2在HEK293細胞中蛋白表達44
• 2.3.3 細胞免疫熒光和激光共聚焦技術觀察三個蛋白與LOC401296的定位44-50
• 2.4 小結50-52
• 第3章 討論52-56
• 3.1 ProquestTM Two-Hybrid System的優(yōu)勢52-53
• 3.2 顆粒蛋白（GRN）53
• 3.3 磷脂爬行酶 1（PLSCR1）53
• 3.4 Notch353-54
• 3.5 表皮生長因子樣結構域 7（EGFL7）54
• 3.6 纖維粘連蛋白-1（FN1）54
• 3.7 隱性TGF-β 結合蛋白-3（LTBP3）54-55
• 3.8 ADAMTS-L455
• 3.9 N4BP2L255-56
• 3.10 LOC401296蛋白質相互作用網絡的構建56
• 參考文獻56-61
• 第4章 綜述61-72
• 4.1 相互作用蛋白組學在系統(tǒng)生物學中的地位61-62
• 4.1.1 蛋白質相互作用的核心作用61-62
• 4.2 篩選相互作用蛋白的方法62-64
• 4.2.1 酵母雙雜交技術62-63
• 4.2.2 親和純化偶聯(lián)質譜法63-64
• 4.2.3 酵母雙雜交和親和純化偶聯(lián)質譜法的比較64
• 4.3 體內的相互作用-酵母雙雜交技術64-69
• 4.3.1 酵母雙雜交技術的原理64-66
• 4.3.2 現(xiàn)有酵母雙雜交系統(tǒng)及其優(yōu)勢66-68
• 4.3.3 酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性68-69
• 4.4 小結69
• 參考文獻69-72
• 結論72-73
• 致謝73-74
• 導師簡介74-75
• 作者簡介75-76
• 學位論文數(shù)據(jù)集76

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