發(fā)布時(shí)間：2017-06-13 20:06

  本文關(guān)鍵詞：LOC401296分子相互作用蛋白的篩選和鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的采用酵母雙雜交系統(tǒng),尋找與LOC401296存在相互作用的蛋白,通過(guò)對(duì)相互作用蛋白的分析,以進(jìn)一步了解LOC401296的功能。方法1采用酵母雙雜交的方法篩選LOC401296的相互作用蛋白。首先構(gòu)建p DBLeu-loc融合表達(dá)載體,再將p DBLeu-loc轉(zhuǎn)入Ma V203酵母菌株,并進(jìn)行毒性和自激活檢測(cè);然后篩選成人肝c DNA文庫(kù),進(jìn)行陽(yáng)性克隆三報(bào)告基因表型鑒定;最后陽(yáng)性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證,排除假陽(yáng)性克隆。生物信息學(xué)分析篩選到的陽(yáng)性克隆。2采用細(xì)胞免疫熒光方法聯(lián)合激光共聚焦技術(shù)觀察LOC401296與相互作用蛋白在HEK293細(xì)胞中的共定位。結(jié)果1通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選出了LOC401296相互作用蛋白。成功構(gòu)建p DBLeu-loc融合表達(dá)載體,并對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。將得到的陽(yáng)性基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析共得到8個(gè)陽(yáng)性克隆。2成功構(gòu)建p EGFP-GRN、p EGFPPLSCR1、p EGFP-N4BP2L2三個(gè)融合表達(dá)載體。采用細(xì)胞免疫熒光方法聯(lián)合激光共聚焦技術(shù)觀察LOC401296分別與GRN、PLSCR1、N4BP2L2在HEK293細(xì)胞中共定位情況,發(fā)現(xiàn)LOC401296與3個(gè)相互作用蛋白均存在共定位。結(jié)論1通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選LOC401296的相互作用蛋白,共篩選出8個(gè)陽(yáng)性克隆,分別為GRN、PLSCR1、N4BP2L2、FN1、NOTCH3、LTBP3、ADAMTS-L4、EGFL7,這些基因各具功能,這表明了LOC401296參與的生物學(xué)過(guò)程的多樣性及其作用機(jī)制的復(fù)雜性。2通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法聯(lián)合激光共聚焦技術(shù)對(duì)LOC401296和GRN、PLSCR1、N4BP2L2進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)定位研究,觀察到LOC401296與GRN、PLSCR1、N4BP2L2在HEK293細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及良好的共定位情況,為后續(xù)研究LOC401296的功能提供了線索。
【關(guān)鍵詞】：LOC401296 酵母雙雜交技術(shù) 相互作用蛋白
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q51;R3411
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 英文縮略表9-10
• 引言10-12
• 第1章 酵母雙雜交技術(shù)篩選相互作用蛋白12-31
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料12-17
• 1.1.1 菌株、細(xì)胞、載體12-14
• 1.1.2 主要酶制劑、試劑盒、試劑14-15
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備15
• 1.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配制15-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-23
• 1.2.1 PDBLeu-LOC誘餌載體的構(gòu)建17-18
• 1.2.2 PDBLeu-LOC誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母及毒性、自激活檢測(cè)18-20
• 1.2.3 pDBLeu-loc作為誘餌篩選成人肝cDNA文庫(kù)20-23
• 1.2.4 陽(yáng)性酵母菌落的鑒定23
• 1.2.5 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證23
• 1.3 結(jié)果23-30
• 1.3.1 誘餌載體pDBLeu-loc構(gòu)建23-24
• 1.3.2 誘餌質(zhì)粒pDBLeu-loc在MaV203酵母菌株中毒性及自激活檢測(cè)24-25
• 1.3.3 以pDBLeu-loc為誘餌篩選成人肝cDNA文庫(kù)25-27
• 1.3.4 陽(yáng)性克隆質(zhì)�；剞D(zhuǎn)驗(yàn)證27-28
• 1.3.5 陽(yáng)性克隆獵物質(zhì)粒測(cè)序與分析28-29
• 1.3.6 陽(yáng)性克隆文庫(kù)質(zhì)粒序列編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析29-30
• 1.4 小結(jié)30-31
• 第2章 LOC401296及相互作用蛋白的共定位31-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-35
• 2.1.1 菌株、細(xì)胞、載體31
• 2.1.2 主要酶制劑、試劑盒、試劑31-32
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備32-33
• 2.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配制33-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 2.2.1 pEGFP-GRN、pEGFP-PLSCR1、pEGFP-N4BP2L2載體的構(gòu)建35-37
• 2.2.2 GRN、PLSCR1、N4BP2L2的pEGFP融合質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)37-39
• 2.2.3 細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦技術(shù)觀察三個(gè)蛋白與LOC401296共定位39-40
• 2.3 結(jié)果40-50
• 2.3.1 pEGFP-GRN、pEGFP -PLSCR1、pEGFP -N4BP2L2載體的構(gòu)建40-44
• 2.3.2 Western Blot檢測(cè)pEGFP-GRN、pEGFP-PLSCR1、pEGFP-N4BP2L2在HEK293細(xì)胞中蛋白表達(dá)44
• 2.3.3 細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦技術(shù)觀察三個(gè)蛋白與LOC401296的定位44-50
• 2.4 小結(jié)50-52
• 第3章 討論52-56
• 3.1 ProquestTM Two-Hybrid System的優(yōu)勢(shì)52-53
• 3.2 顆粒蛋白（GRN）53
• 3.3 磷脂爬行酶 1（PLSCR1）53
• 3.4 Notch353-54
• 3.5 表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域 7（EGFL7）54
• 3.6 纖維粘連蛋白-1（FN1）54
• 3.7 隱性TGF-β 結(jié)合蛋白-3（LTBP3）54-55
• 3.8 ADAMTS-L455
• 3.9 N4BP2L255-56
• 3.10 LOC401296蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 第4章 綜述61-72
• 4.1 相互作用蛋白組學(xué)在系統(tǒng)生物學(xué)中的地位61-62
• 4.1.1 蛋白質(zhì)相互作用的核心作用61-62
• 4.2 篩選相互作用蛋白的方法62-64
• 4.2.1 酵母雙雜交技術(shù)62-63
• 4.2.2 親和純化偶聯(lián)質(zhì)譜法63-64
• 4.2.3 酵母雙雜交和親和純化偶聯(lián)質(zhì)譜法的比較64
• 4.3 體內(nèi)的相互作用-酵母雙雜交技術(shù)64-69
• 4.3.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理64-66
• 4.3.2 現(xiàn)有酵母雙雜交系統(tǒng)及其優(yōu)勢(shì)66-68
• 4.3.3 酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性68-69
• 4.4 小結(jié)69
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 結(jié)論72-73
• 致謝73-74
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介74-75
• 作者簡(jiǎn)介75-76
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集76

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