目的應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除編碼小鼠T、B細(xì)胞的Rag2基因及編碼NK細(xì)胞的IL2rg基因,構(gòu)建T、B細(xì)胞及NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷小鼠。方法根據(jù)Genbank報(bào)道的Rag2及IL2rg基因序列,分別針對(duì)其外顯子設(shè)計(jì)25 bp左右的sgRNA并進(jìn)行合成,sgRNA退火后克隆入p X330載體。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄為mRNA后顯微注射入BALB/c小鼠受精卵細(xì)胞,受精卵細(xì)胞移植到受體動(dòng)物獲得子代小鼠,首建鼠(F0)與野生型小鼠交配獲得F1代小鼠,突變的F1代小鼠互交后篩選F2代純合子小鼠。通過(guò)基因測(cè)序、流式細(xì)胞技術(shù)及接種人源性腫瘤細(xì)胞系方法檢測(cè)子代小鼠基因型和表型。結(jié)果成功構(gòu)建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重組質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄,mRNA顯微注射并移植后獲得57只F0小鼠。連續(xù)交配后,獲得F2代純合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有兩個(gè)基因型,分別是10 bp和11 bp的缺失突變;而Rag2只有一個(gè)基因型,為8 bp的缺失突變。與野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 寡核苷酸合成及質(zhì)粒構(gòu)建
        1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄
        1.2.3 mRNA顯微注射及受精卵細(xì)胞移植
        1.2.4 基因敲除小鼠品系建立及基因型鑒定
        1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)鑒定小鼠表型
        1.2.6 腫瘤移植模型鑒定小鼠表型
2 結(jié)果
    2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及RNA轉(zhuǎn)錄
    2.2 基因敲除小鼠品系的建立及基因型鑒定
    2.3 基因敲除小鼠表型鑒定
3 討論



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