目的建立漢灘病毒(Hantaan virus, HTNV)微基因組系統(tǒng),并進行初步評價。方法用分子克隆方法構建HTNV微基因組系統(tǒng)所需的微基因組質(zhì)粒和表達核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, NP)、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)的輔助質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞;并在輔助病毒添加與否的情況下進行驗證。結果成功構建了基于HTNV L片段非編碼區(qū)的綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)和Gaussia熒光素酶(gaussia luciferase, Gluc)的微基因組質(zhì)粒,GFP微基因組在輔助病毒HTNV感染的情況下可觀察到明顯綠色熒光,Gluc微基因組在輔助病毒感染或者輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染情況下均可檢測到Gluc的表達。結論成功建立了HTNV的微基因組系統(tǒng),為研究HTNV的復制機理和抗病毒藥物的篩選提供了重要工具。

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【部分圖文】：

圖2輔助質(zhì)粒的構建與鑒定

圖1微基因組質(zhì)粒的構建與鑒定2.2GFP微基因組系統(tǒng)的活性評價

圖4Gluc微基因組系統(tǒng)的活性評價

圖3GFP微基因組質(zhì)粒的活性鑒定(×200)3討論

圖1微基因組質(zhì)粒的構建與鑒定

輔助質(zhì)粒構建與鑒定:①通過亞克隆獲得NP哺乳動物表達質(zhì)粒pCAG-NP,并經(jīng)EcoRI和KpnI雙酶切鑒定可觀察到大小約1.3kb目的條帶,見圖2A;②分片段全基因合成的pUC-L1、pUC-L2和pUC-L3經(jīng)KpnI和SalI雙酶切后獲得相應大小的目的條帶,見圖2B....

圖3GFP微基因組質(zhì)粒的活性鑒定(×200)

在細胞培養(yǎng)上清中,與單轉(zhuǎn)質(zhì)粒組相比,感染HTNV可明顯提高Gluc水平,但三轉(zhuǎn)質(zhì)粒組僅有較低水平的升高;三轉(zhuǎn)質(zhì)粒并感染HTNV組與三轉(zhuǎn)質(zhì)粒組的Gluc水平相差不大。因為Gluc具有信號肽,表達產(chǎn)物主要分泌至細胞上清,所以在細胞裂解液中Gluc水平相差不大,見圖4。圖4Gluc微....

本文編號：3962028