本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌小RNA T64的相關(guān)功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:隨著生物信息學(xué)預(yù)測和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,在細(xì)菌基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)了越來越多的小RNA(small RNA,sRNA),其作為基因表達(dá)的調(diào)控因子,在細(xì)菌的生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。T64為本研究組在傷寒沙門菌中新發(fā)現(xiàn)的sRNA,其基因位置和表達(dá)特性都已經(jīng)在前期研究中得到論證,本論文擬對該小RNA在傷寒沙門菌中的相關(guān)功能進(jìn)行探究。方法:1.T64高表達(dá)菌株的制備。根據(jù)前期研究獲得的sRNA T64基因序列,在轉(zhuǎn)錄起始端和終止端處分別設(shè)計上下游引物,擴(kuò)增獲得編碼T64的基因片段,經(jīng)Nco I和Hind III雙酶切,與同樣雙酶切的質(zhì)粒pBAD/Myc-His A定向連接,并導(dǎo)入大腸桿菌DH5α。篩選出陽性克隆,從中提取重組質(zhì)粒電擊導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株,作為sRNA T64高表達(dá)菌株。2.在hfq基因缺陷株中高表達(dá)T64。提取攜帶編碼T64的基因片段的重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)導(dǎo)入傷寒沙門菌hfq基因缺陷株,在hfq基因缺陷株中誘導(dǎo)T64高表達(dá)。3.T64高表達(dá)菌株生長曲線測定。將T64高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株分別在TSB中振蕩培養(yǎng),每隔1 h檢測1次菌液的OD600值,連續(xù)測量10 h。以生長時間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線,比較T64高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株的生長情況。4.T64高表達(dá)菌株的動力實(shí)驗。將T64高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600 0.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h,以誘導(dǎo)T64表達(dá),分別取T64高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株的1μl菌液點(diǎn)種于含0.3%瓊脂糖的LB或TSB半固體培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)12 h后測量動力圈直徑,比較細(xì)菌的動力。5.實(shí)時熒光定量pcr檢測基因轉(zhuǎn)錄水平。細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)后,以trizol法提取總rna,用特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量pcr,分析野生株在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)時t64的表達(dá)差異,以及t64高表達(dá)菌株中生物膜形成相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。6.生物膜形成實(shí)驗。將細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)期(od6000.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖繼續(xù)培養(yǎng)0.5h,以誘導(dǎo)t64表達(dá),取菌液接種于96孔板,30°c靜置4天,結(jié)晶紫染色后570nm比色定量。7.剛果紅實(shí)驗。過夜培養(yǎng)的t64高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株菌液離心收菌,用pbs重懸菌體沉淀并調(diào)節(jié)菌量一致。滴種5μl重懸液到剛果紅平板上,28°c靜置3天,觀察菌苔形態(tài)。結(jié)果:1.酶切、pcr驗證和序列分析結(jié)果顯示,成功構(gòu)建陽性重組載體pbad-t64,并將其導(dǎo)入s.typhi野生株,成功制備srnat64高表達(dá)菌株(wt+pbad-t64)。2.pcr驗證結(jié)果顯示,傷寒沙門菌hfq基因缺陷株中成功導(dǎo)入了pbad-t64,即菌株Δhfq+pbad-t64制備成功。3.生長曲線結(jié)果表明,在一定時間內(nèi),t64高表達(dá)菌株生長速度明顯快于空載體對照株。4.動力實(shí)驗表明,在tsb半固體培養(yǎng)基中,t64高表達(dá)菌株的動力較空質(zhì)粒對照株稍稍減弱;而在lb半固體培養(yǎng)基中,兩者動力幾乎無差別。5.熒光定量pcr結(jié)果顯示,野生株在lb和tsb兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)時t64的表達(dá)量有差異,在tsb中t64的表達(dá)量明顯升高;在t64高表達(dá)菌株中,生物膜形成相關(guān)靶基因fimy、pilp、stcb和stgd轉(zhuǎn)錄均上調(diào)。6.生物膜形成實(shí)驗結(jié)果顯示,t64高表達(dá)菌株的生物膜形成能力強(qiáng)于空載體對照株;回補(bǔ)T64基因后,T64缺陷株生物膜形成能力基本恢復(fù);hfq基因缺陷株即使高表達(dá)T64也難以形成生物膜。7.剛果紅實(shí)驗結(jié)果顯示,T64高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株都只能形成光滑和白色的菌苔,未展現(xiàn)出與生物膜形成對應(yīng)的菌落形態(tài)。結(jié)論:傷寒沙門菌小RNA T64的表達(dá)受到培養(yǎng)條件的影響,高表達(dá)T64后能促進(jìn)細(xì)菌的生長,并且能在一定程度上抑制細(xì)菌的動力。T64有助于傷寒沙門菌形成生物膜并促進(jìn)生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá),但不足以消除hfq基因缺失對生物膜形成的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：傷寒沙門菌 小RNA T64 生長 動力 生物膜形成
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.22
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 英文縮寫索引14-15
• 1 緒論15-19
• 1.1 傷寒沙門菌簡介15
• 1.2 細(xì)菌中的sRNA15-16
• 1.3 細(xì)菌的生物膜16-17
• 1.4 細(xì)菌sRNA與生物膜的關(guān)系17-18
• 1.5 傷寒沙門菌sRNA T64的研究現(xiàn)狀18
• 1.6 本論文研究內(nèi)容18-19
• 2 本論文的研究目的、技術(shù)路線、材料方法19-30
• 2.1 研究目的19
• 2.2 技術(shù)路線19-20
• 2.2.1 制備sRNA T64研究模型菌株19
• 2.2.2 分析細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中T64的表達(dá)差異19-20
• 2.2.3 關(guān)于T64的功能研究20
• 2.3 實(shí)驗材料20-22
• 2.3.1 菌株和質(zhì)粒20
• 2.3.2 主要試劑和材料20-21
• 2.3.3 主要溶液21
• 2.3.4 主要儀器21-22
• 2.4 實(shí)驗方法22-30
• 2.4.1 傷寒沙門菌T64高表達(dá)菌株（WT+pBAD-T64）的制備22-26
• 2.4.2 菌株 Δhfq+pBAD-T64的制備26
• 2.4.3 T64高表達(dá)菌株的生長曲線測定26
• 2.4.4 T64高表達(dá)菌株的動力實(shí)驗26
• 2.4.5 各型菌株的生物膜形成實(shí)驗26-27
• 2.4.6 T64高表達(dá)菌株的剛果紅實(shí)驗27
• 2.4.7 T64及其生物膜形成相關(guān)靶基因的實(shí)時熒光定量PCR分析27-30
• 3 實(shí)驗結(jié)果與討論30-47
• 3.1 實(shí)驗結(jié)果30-40
• 3.1.1 傷寒沙門菌T64高表達(dá)菌株的制備結(jié)果30-32
• 3.1.2 菌株 Δhfq+pBAD-T64的制備結(jié)果32-33
• 3.1.3 T64高表達(dá)菌株的生長曲線33-34
• 3.1.4 T64對傷寒沙門菌動力的影響34-35
• 3.1.5 各型菌株生物膜形成實(shí)驗的結(jié)果35-37
• 3.1.6 T64高表達(dá)菌株剛果紅實(shí)驗的結(jié)果37-38
• 3.1.7 T64及其生物膜形成相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果38-40
• 3.2 討論40-47
• 3.2.1 T64高表達(dá)菌株的制備40-41
• 3.2.2 T64與細(xì)菌動力41-42
• 3.2.3 T64與細(xì)菌生長42
• 3.2.4 生物膜結(jié)晶紫染色與剛果紅實(shí)驗42-44
• 3.2.5 T64與Hfq44
• 3.2.6 T64生物膜形成相關(guān)靶基因44-45
• 3.2.7 T64對生物膜形成相關(guān)靶基因的調(diào)節(jié)45-47
• 4 主要結(jié)論及展望47-48
• 4.1 主要結(jié)論47
• 4.2 展望47-48
• 參考文獻(xiàn)48-57
• 致謝57-58
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文58

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魯慧英;Detection of hepatitis C virus RNA sequences in cholangiocarcinomas in Chinese and American patients[J];Chinese Medical Journal;2000年12期

2 ;Detection the HCV RNA by PCR-microplate hybridization method from clinical specimens[J];中國輸血雜志;2001年S1期

3 付漢江,鄭曉飛;類mRNA RNA研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);2002年04期

4 Verheyden B ,徐其武;口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗核殼和RNA的穩(wěn)定性[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2002年01期

5 CMBE譯文組;探索小RNA的功能[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志;2004年03期

6 沈維干;RNA interference and its current application in mammals[J];Chinese Medical Journal;2004年07期

7 ;Potent and specific inhibition of SARS-CoV antigen expression by RNA interference[J];Chinese Medical Journal;2005年09期

8 孫娣;汪洋;張麗娟;閆玉清;;一種簡捷提取植物總RNA的方法[J];黑龍江醫(yī)藥;2005年06期

9 熊慧華;于世英;胡廣原;莊亮;;Effects of Survivin Expression Suppressed by Short Hairpin RNA on MCF-7 Cells[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)英德文版);2006年03期

10 楊益超;;RNA干擾及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J];廣西醫(yī)學(xué);2007年10期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金由辛;;面向21世紀(jì)的RNA研究[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊）[C];1999年

2 ;第四屆RNA全國研討會大會報告日程安排[A];第四屆全國RNA進(jìn)展研討會論文集[C];2005年

3 ;Function of Transfer RNA Modifications in Plant Development[A];植物分子生物學(xué)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——全國植物生物學(xué)研討會論文摘要集[C];2010年

4 王峰;張秋平;陳金湘;;棉花總RNA的快速提取方法[A];中國棉花學(xué)會2011年年會論文匯編[C];2011年

5 關(guān)力;陳本iY;iJ云虹;郭培芝;魏重琴;邱蘇吾;苗健;;關(guān)于動物}D~T中RNAn,定方法的研究[A];中國生理科學(xué)會學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編（生物化學(xué)）[C];1964年

6 夏海濱;;小RNA在免疫學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進(jìn)展[A];中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

7 ;The stability of hepatitis C virus RNA in various handling and storage conditions[A];中國輸血協(xié)會第四屆輸血大會論文集[C];2006年

8 郭德銀;;RNA干擾在病毒研究和控制中的應(yīng)用[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

9 甘儀梅;楊業(yè)華;王學(xué)奎;曹燕;楊特武;;棉花總RNA快速提取[A];中國棉花學(xué)會2007年年會論文匯編[C];2007年

10 ;Identification and characterization of novel interactive partner proteins for PCBP1 that is a RNA-binding protein[A];中國優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會第四屆全國學(xué)術(shù)論文報告會暨基因科學(xué)高峰論壇論文專輯[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 馮衛(wèi)東;研究人員發(fā)現(xiàn)可破壞腫瘤抑制基因的小RNA[N];科技日報;2009年

2 記者 儲笑抒 通訊員 盛偉;人體微小RNA有望提前發(fā)出癌癥預(yù)警[N];南京日報;2011年

3 瀘州醫(yī)學(xué)院副教授、科普作家 周志遠(yuǎn);“大頭兒子”與環(huán)狀RNA[N];第一財經(jīng)日報;2014年

4 麥迪信;小分子RNA可能有大作用[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2003年

5 董映璧;美發(fā)現(xiàn)基因調(diào)控可回應(yīng)“RNA世界”[N];科技日報;2006年

6 張忠霞;特制RNA輕推一下,就能“喚醒”基因[N];新華每日電訊;2007年

7 聶翠蓉;RNA：縱是配角也精彩[N];科技日報;2009年

8 馮衛(wèi)東;RNA干擾機(jī)制首次在人體中獲得證實(shí)[N];科技日報;2010年

9 馮衛(wèi)東　王小龍;英在地球早期環(huán)境模擬條件下合成類RNA[N];科技日報;2009年

10 記者 常麗君;新技術(shù)讓研究進(jìn)入單細(xì)胞內(nèi)RNA的世界[N];科技日報;2011年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王趙瑋;昆蟲RNA病毒復(fù)制及昆蟲抗病毒天然免疫機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2014年

2 包純;一類新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)以及產(chǎn)生和功能的初探[D];華中師范大學(xué);2015年

3 李語麗;基于MeRIP-seq的水稻RNA m6A甲基化修飾的研究[D];中國科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

4 熊瑜琳;miR-122靶位基因STAT3調(diào)控長鏈非編碼 RNA Lethe促進(jìn)HCV復(fù)制的機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 范春節(jié);高通量測序鑒定毛竹小RNA及其功能分析[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2012年

6 王加強(qiáng);小鼠著床前胚胎特異ERV相關(guān)長非編碼RNA的定向篩選及功能研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 王業(yè)偉;非編碼RNA SPIU的結(jié)構(gòu)和功能研究和p19INK4D在APL發(fā)病中的作用[D];上海交通大學(xué);2013年

8 鄒艷芬;子癇前期中非編碼RNA對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控及機(jī)制探索[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

9 朱喬;miR-10b在人肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步探索[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 蔣俊鋒;長鏈非編碼RNA BACE1-AS促進(jìn)Aβ聚集及其調(diào)節(jié)BACE1和SERF1a的ceRNA機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陸聰兒;條紋斑竹鯊再生肝臟中差異RNA的研究[D];浙江理工大學(xué);2015年

2 張曉輝;小鼠幾種長鏈非編碼RNA基因功能的初步研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

3 全弘揚(yáng);長鏈非編碼RNA在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的相關(guān)作用及機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 胡亮;DDX19A識別PRRSV基因組RNA并激活NLRP3炎癥小體[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

5 張帥兵;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對旋毛蟲Nudix水解酶基因功能的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

6 鄭芳芳;肺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)中RNA編輯事件的識別算法和系統(tǒng)分析[D];蘇州大學(xué);2015年

7 陳瑞東;長鏈非編碼RNA MEG3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的實(shí)驗研究[D];蘇州大學(xué);2015年

8 劉駿武;線蟲和水稻中環(huán)狀RNA的預(yù)測及分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 李猷;利用RNA干擾技術(shù)提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D];牡丹江師范學(xué)院;2015年

10 吳術(shù)盛;SVCV感染EPC細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌小RNA T64的相關(guān)功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：392725