納米抗體(nanobody)是一種新型的小分子抗體片段,由駝類天然的重鏈抗體重鏈可變區(qū)(variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies,VHH)克隆獲得。分子量是完整抗體的十分之一,具有優(yōu)良的生物學特性,擁有完整的抗原結(jié)合位點、耐惡劣條件(如低p H,高溫)和低免疫原性、很好的組織穿透性,特異性高,水溶性好。工程化單克隆抗體片段由于其多功能性和潛力而受到市場關(guān)注,被認為是未來免疫診斷和治療的藥物重要組成部分并具備較為廣闊的發(fā)展前景。相同納米抗體在不同表達系統(tǒng)中的表達方法以及表達質(zhì)量,目前并沒有得到系統(tǒng)深入的研究。本論文選取7D12和9G8兩種納米抗體,在大腸桿菌和畢赤酵母兩種表達系統(tǒng)中分別表達進而比較差異,通過這種比較,為納米抗體的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎。研究的具體內(nèi)容如下:本論文利用基因工程方法,分別構(gòu)建適合大腸桿菌系統(tǒng)表達的PET28a-7D12/PET28a-9G8重組質(zhì)粒以及適合畢赤酵母表達系統(tǒng)的p GAPZa A-7D12/p GAPZa A-9G8重組質(zhì)粒,為后續(xù)表達蛋白提供基礎。本論文首先對納米抗體7D...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 納米抗體(Nanobody,Nb)研究進展
        1.1.1 納米抗體
        1.1.2 納米抗體的優(yōu)勢
        1.1.3 納米抗體的應用
        1.1.4 納米抗體7D12
        1.1.5 納米抗體9G8
    1.2 納米抗體的表達系統(tǒng)
        1.2.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)
        1.2.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)
第二章 表達載體的構(gòu)建
    2.1 實驗儀器與試劑
        2.1.1 實驗儀器
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 設計合成及PCR擴增
        2.2.2 純化和電泳鑒定
        2.2.3 質(zhì)粒的酶切與連接
        2.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 目的片段的PCR擴增
        2.3.2 質(zhì)粒的酶切與連接
        2.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定
第三章 納米抗體在不同表達系統(tǒng)中表達及鑒定
    3.1 實驗儀器與試劑
        3.1.1 實驗儀器
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 轉(zhuǎn)化X33酵母及表達蛋白的純化與鑒定
        3.2.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21及蛋白的表達
        3.2.3 變復性及樣品純化與鑒定
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 轉(zhuǎn)化X33酵母及表達蛋白的純化與鑒定
        3.3.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21及表達蛋白的純化與鑒定
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 納米抗體的中試發(fā)酵放大生產(chǎn)及純化鑒定
    4.1 實驗儀器與試劑
        4.1.1 實驗儀器
        4.1.2 實驗試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 7D12蛋白中試發(fā)酵
            4.2.1.1 制備種子液
            4.2.1.2 目的蛋白的中試發(fā)酵生產(chǎn)
            4.2.1.3 誘導表達階段
            4.2.1.4 中試發(fā)酵的鑒定
            4.2.1.5 發(fā)酵液初處理
        4.2.2 7D12蛋白純化
            4.2.2.1 Ni-NTA填料裝柱
            4.2.2.2 Ni-NTA柱再生步驟
            4.2.2.3 AKTA純化步驟
            4.2.2.4 純化得到的蛋白樣品處理
        4.2.3 純化樣品檢測
            4.2.3.1 液相色譜檢測
            4.2.3.2 BCA蛋白定量
            4.2.3.3 PPSQ-51A蛋白質(zhì)測序
            4.2.3.4 飛行時間質(zhì)譜檢測
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 中試發(fā)酵電泳鑒定結(jié)果
        4.3.2 AKTA純化電泳及液相檢測結(jié)果
        4.3.3 蛋白純化液相色譜圖
        4.3.4 BCA定量檢測結(jié)果
        4.3.5 PPSQ-51A蛋白質(zhì)測序結(jié)果
        4.3.6 飛行質(zhì)譜檢測結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論
參考文獻
致謝



本文編號：3897256