本文關(guān)鍵詞：淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB和NspA表位肽的預(yù)測和實(shí)驗(yàn)篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測淋病奈瑟菌外膜蛋白PⅠ和Nsp A的二級結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢B細(xì)胞和T細(xì)胞表位肽,并進(jìn)行人工合成。檢測人工合成表位多肽與抗體的親和能力以及刺激淋巴細(xì)胞增殖的程度,以篩選出抗原性較好的表位肽作為淋球菌候選表位肽,為后續(xù)淋球菌表位疫苗的研制提供了思路和理論依據(jù)。方法 1淋球菌外膜蛋白優(yōu)勢B細(xì)胞、T細(xì)胞表位肽的預(yù)測:選用本實(shí)驗(yàn)室先前實(shí)驗(yàn)研究中經(jīng)測序確定的淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC 29403的por B基因全長核苷酸序列,運(yùn)用DNAStar軟件將其核苷酸序列轉(zhuǎn)化成為氨基酸序列,共348個(gè)氨基酸殘基;Nsp A氨基酸序列則用Gene Bank中的WHO-A株,共174個(gè)氨基酸序列。應(yīng)用在線工具TMHMM對Por B和Nsp A全長氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)域的分析,利用EXPASY服務(wù)器上的GOR4和SOPMA工具預(yù)測Por B和Nsp A的二級結(jié)構(gòu),通過DNAStar軟件Protean模塊的Karplus-Schulz方法、Kyte-Doolittle方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析Por B和Nsp A蛋白的柔韌性、親水性、表面可及性和抗原性,以綜合預(yù)測其優(yōu)勢B細(xì)胞表位。選擇常見的HLA基因型,并兼顧小鼠H2-Ed、Ek限制性,利用SYFPEITHI軟件以多肽上氨基酸是否為錨定殘基、輔助殘基或優(yōu)勢殘基進(jìn)行記分,選擇得分高的肽段作為候選T細(xì)胞表位,Net MHC-II軟件則以肽段分子與MHC分子的親和力為判斷依據(jù),親和力強(qiáng)則肽段的抗原性較高,綜合SYFPEITHI和Net MHC-II兩個(gè)軟件的分析結(jié)果并確定T細(xì)胞抗原表位存在的可能區(qū)域,將預(yù)測出的表位多肽交由公司合成。2優(yōu)勢表位肽的實(shí)驗(yàn)篩選:采用甲醛處理法、乙醇處理法和加熱法制備淋球菌全細(xì)胞抗原,經(jīng)革蘭染色后顯微鏡鏡檢,以確定最佳的全細(xì)胞抗原制備方法。選用最佳方法制備滅活的全細(xì)胞抗原,經(jīng)無菌測試后,免疫BALB/c小鼠,收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞和免疫血清。經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測定多肽刺激淋巴細(xì)胞增殖的程度;通過ELISA法測定多肽對小鼠免疫血清的反應(yīng)性,以初步評價(jià)多肽與特異性抗體的親和能力。從而篩選出具有良好抗原性的優(yōu)勢表位肽。結(jié)果 1 Por B蛋白的N端1-20位氨基酸為跨膜區(qū),20位以后的氨基酸則位于膜外;Nsp A蛋白的N端1-25位氨基酸為跨膜區(qū),25位以后的氨基酸則位于膜內(nèi);Por B和Nsp A的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主,亦可見α螺旋和β折疊;綜合其柔韌性、親水性、表面可及性和抗原性特征顯示Por B蛋白優(yōu)勢B細(xì)胞表位可能存在于氨基酸序列N端的168~178和127~133兩個(gè)區(qū)段。Nsp A潛在優(yōu)勢B細(xì)胞抗原肽表位則位于第90~99和70~76肽段。SYFPEITHI和Net MHC-II兩種軟件預(yù)測出Por B的T細(xì)胞優(yōu)勢表位可能位于第212~226,229~243位氨基酸,Nsp A的T細(xì)胞表位存在于129~137,2~16氨基酸。2顯微鏡檢查結(jié)果提示:乙醇處理法制備的淋球菌全細(xì)胞抗原質(zhì)量最佳,其次為甲醛,加熱處理的全細(xì)胞抗原數(shù)量少,菌體完整性有所破壞,隨加熱溫度提高,淋球菌全細(xì)胞抗原質(zhì)量越差。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Nsp A蛋白的B細(xì)胞表位91~99氨基酸序列、Por B蛋白B細(xì)胞表位168~178氨基酸序列能有效刺激全細(xì)胞抗原免疫后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖;Nsp A蛋白的T細(xì)胞表位130~137和2~16位氨基酸序列,Por B蛋白的T細(xì)胞表位212~226、229~243位氨基酸序列能有效刺激全細(xì)胞抗原免疫后的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞增殖。ELISA法檢測表明Por B蛋白的B細(xì)胞表位168~178氨基酸序列、Nsp A蛋白B細(xì)胞表位91~99氨基酸序列與淋球菌全細(xì)胞抗原特異性血清親和能力較強(qiáng),其中Por B蛋白的B細(xì)胞表位168~178氨基酸序列與淋球菌全細(xì)胞抗原特異性血清親和能力強(qiáng)于Nsp A蛋白B細(xì)胞表位91~99氨基酸序列。結(jié)論通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測出了淋球菌外膜蛋白Por B和Nsp A的T細(xì)胞和B細(xì)胞可能的抗原表位。通過淋球菌全細(xì)胞抗原免疫小鼠后,收集淋巴結(jié)和脾臟淋巴細(xì)胞以及免疫血清,通過淋巴細(xì)胞增殖和ELISA法可檢測和篩選經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測出的多肽表位的抗原性。本研究結(jié)果表明:Nsp A蛋白中130~137和2~16氨基酸序列,Por B蛋白中229~243、212~226氨基酸序列可作為淋球菌疫苗研制中的優(yōu)勢T細(xì)胞表位,Nsp A蛋白中91~99氨基酸序列、Por B蛋白中168~178氨基酸序列,可作為淋球菌疫苗研制中的優(yōu)勢B細(xì)胞表位。本研究結(jié)果為后續(xù)淋球菌表位疫苗的研制提供了思路和理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：淋病奈瑟菌 外膜蛋白 生物信息學(xué) 表位肽預(yù)測 表位肽篩選
【學(xué)位授予單位】：大理學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-15
• 實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 技術(shù)路線18-19
• 第一部分淋球菌外膜蛋白Por B和Nsp A表位肽的預(yù)測19-29
• 1 引言19
• 2 方法19-21
• 3 結(jié)果21-27
• 4 討論27-29
• 第二部分Por B和Nsp A蛋白優(yōu)勢抗原表位肽的篩選29-42
• 1 引言29
• 2 方法29-35
• 3 結(jié)果35-39
• 4 討論39-42
• 全文總結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-49
• 附錄49-50
• 文獻(xiàn)綜述50-57
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：383258