本文關(guān)鍵詞：多重耐藥質(zhì)粒pYN1在不同種屬細(xì)菌中的水平轉(zhuǎn)移能力研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著抗生素的廣泛使用,尤其是前期抗生素不合理的濫用,造成臨床和環(huán)境中產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性,給人類醫(yī)療和健康帶來巨大威脅。其中,耐藥基因由于在環(huán)境中不易降解、能夠通過基因水平轉(zhuǎn)移傳播等特性而被作為一種污染物提出來,具有比抗生素本身更大的危害性。耐藥基因主要存在于細(xì)菌的質(zhì)粒上,其在環(huán)境中的水平轉(zhuǎn)移主要通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和噬菌體介導(dǎo),其中質(zhì)粒是最重要的傳播方式。本研究在實驗室前期工作的基礎(chǔ)上,主要對多重耐藥質(zhì)粒在不同種屬細(xì)菌之間的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行了研究,并探討了抗生素和重金屬暴露條件下對這種傳播的影響。主要研究結(jié)果如下:一、質(zhì)粒pYN1在不同細(xì)菌中的轉(zhuǎn)化能力研究:pYN1來自于本實驗室保存的多重耐藥菌株Escherichia coli Ls1,質(zhì)粒全序列測序結(jié)果表明該質(zhì)粒至少包括對頭孢氨芐、四環(huán)素、卡那霉素三種抗生素的耐藥基因和一個多重耐藥超家族基因。將1.5 ug的Escherichia coli Ls1總質(zhì)粒與100 ul的四種受體菌(枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和變形桿菌均為抗生素敏感菌株),分別在不同的生長時期,室溫下進(jìn)行不同時間階段的靜置共培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒能夠與培養(yǎng)18 h以后的處于穩(wěn)定期的受體菌株發(fā)生有效轉(zhuǎn)化并在包含有三種抗生素的平板上產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子,對轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,均出現(xiàn)一條與多抗性質(zhì)粒PYN1大小(約為15kb)一致的條帶,從而進(jìn)一步證明該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。然而該質(zhì)粒在不同受體菌之間的轉(zhuǎn)化能力存在明顯差異,其轉(zhuǎn)化率大小蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)為8.5×10~(-4)變形桿菌(Proteus vulgaris)為4.7×10~(-6)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)為4.5×10~(-6)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為2×10-7。二、抗生素暴露對質(zhì)粒pYN1在不同菌株中轉(zhuǎn)化能力的影響:通過添加不同濃度、種類的抗生素對于多重耐藥質(zhì)粒pYN1在不同細(xì)菌種屬之間自然轉(zhuǎn)化的能力的影響進(jìn)行研究,得到以下結(jié)論:抗生素的種類和濃度都會影響該質(zhì)粒在受體菌中的轉(zhuǎn)化。在頭孢氨芐0-0.15 ug/ml、四環(huán)素0-0.3 ug/ml、卡那霉素0-1.5 ug/ml的范圍內(nèi),對于質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌和變形桿菌中的轉(zhuǎn)化效率增加10~2-10~3倍。在蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌中降低10-10~2倍;對不同處理條件下的受體菌株進(jìn)行生長曲線測定,發(fā)現(xiàn)是降低的趨勢;進(jìn)行SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)在0.5 ug/ml的卡那霉素和0.2 ug/ml的四環(huán)素處理條件下的枯草芽孢桿菌均有一條大于245 kD的蛋白條帶的出現(xiàn);進(jìn)行HPLC實驗分別發(fā)現(xiàn)在15.057和14.791 min處出現(xiàn)新峰。推測有可能是與抗脅迫作用相關(guān)的蛋白。三、重金屬暴露對質(zhì)粒pYN1在不同菌株中轉(zhuǎn)化能力的影響:選擇環(huán)境中常見的重金屬離子Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)研究了在不同劑量重金屬離子分別暴露的條件下,對于多重耐藥質(zhì)粒pYN1在不同細(xì)菌種屬之間自然轉(zhuǎn)化的能力的影響進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,重金屬會影響該質(zhì)粒在受體菌中的轉(zhuǎn)化。其中,在銅離子濃度0-4 mmol/l范圍內(nèi),對于枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和變形桿菌中的轉(zhuǎn)化效率增加了10~2-10~3倍,蘇云金芽孢桿菌降低了10~3倍;對于錳離子濃度0-9 mmol/l的條件下,在枯草芽孢桿菌和變形桿菌中的轉(zhuǎn)化率是降低的,在蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿是升高的;在鋅離子濃度為0-4mmol/l的范圍內(nèi),對于在枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)化率提高10-10~2倍;對于蘇云金芽孢桿菌和變形桿菌幾乎沒有影響;對于鐵離子濃度0-4 mmol/l的條件下,對于在蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和變形桿菌中的轉(zhuǎn)化率降低10~2-10~3倍,對于在枯草芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)化率是升高的趨勢;對于受體菌株生長曲線的測定,發(fā)現(xiàn)在不同重金屬的處理條件下,對于生長趨勢是增加的;對于枯草芽孢桿菌在不同重金屬處理條件下菌體全蛋白的表達(dá)進(jìn)行SDS-PAGE研究發(fā)現(xiàn),與對照相比,銅離子、錳離子和鋅離子處理條件下的枯草芽孢桿菌新出現(xiàn)一條180 kDa大小的條帶,有可能與應(yīng)對脅迫作用的相關(guān)蛋白表達(dá)量下調(diào);進(jìn)行HPLC實驗發(fā)現(xiàn)在銅離子濃度為2 mmol/l的處理下,與對照組15.072 min出現(xiàn)新峰。推測可能是與應(yīng)對脅迫作用相關(guān)的蛋白。
【關(guān)鍵詞】：抗生素 重金屬 多重耐藥質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 生態(tài)風(fēng)險
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 引言12-24
• 1.1 抗生素的發(fā)展歷史12-13
• 1.2 抗生素的種類13
• 1.3 抗生素抗性機(jī)制的闡明13-14
• 1.4 抗生素抗性的產(chǎn)生與傳播遷移14-16
• 1.5 細(xì)菌耐藥性的檢測方法的闡述16-17
• 1.6 抗生素殘留對環(huán)境的影響17-18
• 1.7 環(huán)境中抗生素耐藥基因的研究現(xiàn)狀18-22
• 1.8 本研究的目的與意義22-24
• 第二章 多重耐藥質(zhì)粒pYN1能否在不同細(xì)菌種屬之間自然轉(zhuǎn)化的研究24-36
• 2.1 前言24
• 2.2 材料和方法24-31
• 2.2.1 藥品24-25
• 2.2.2 培養(yǎng)基25
• 2.2.3 抗生素儲備液的制備25
• 2.2.4 抗生素抗性平板的制備25-26
• 2.2.5 主要儀器26
• 2.2.6 實驗材料26-27
• 2.2.7 多抗性菌株的活化27
• 2.2.8 多抗性菌的總質(zhì)粒的提取27-28
• 2.2.9 提取的總質(zhì)粒與受體菌靜置共培養(yǎng)28
• 2.2.10 轉(zhuǎn)化子驗證并計數(shù)28-30
• 2.2.11 技術(shù)路線30-31
• 2.3 結(jié)果與分析31-35
• 2.3.1 受體菌生長曲線、抗生素MIC值測定以及轉(zhuǎn)化效率的測定31-33
• 2.3.2 質(zhì)粒提取33-34
• 2.3.3 轉(zhuǎn)化子驗證34-35
• 2.4 小結(jié)35-36
• 第三章 添加不同抗生素對于多重耐藥質(zhì)粒pYN1在不同細(xì)菌種屬之間自然轉(zhuǎn)化的影響的研究36-48
• 3.1 前言36
• 3.2 材料和方法36-40
• 3.2.1 藥品及試劑37
• 3.2.2 實驗方法37
• 3.2.3 主要實驗儀器37-38
• 3.2.4 培養(yǎng)基38
• 3.2.5 實驗技術(shù)路線38-39
• 3.2.6 轉(zhuǎn)化子計數(shù)39
• 3.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳39-40
• 3.2.8 高效液相對于菌體全蛋白的表達(dá)檢測40
• 3.3 結(jié)果和分析40-47
• 3.3.1 不同頭孢氨芐濃度對多抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響40-41
• 3.3.2 不同四環(huán)素濃度對多抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響41-42
• 3.3.3 不同卡那霉素對多抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響42-43
• 3.3.4 不同抗生素對枯草芽孢桿菌生長狀態(tài)及蛋白表達(dá)量的影響43-44
• 3.3.5 不同抗生素對變形桿菌生長狀態(tài)及蛋白表達(dá)量的影響44
• 3.3.6 SDS-PAGE檢測不同處理狀態(tài)下枯草芽孢桿菌全蛋白的表達(dá)44-45
• 3.3.7 高效液相對于不同處理條件下菌體全蛋白的表達(dá)檢測45-47
• 3.4 小結(jié)47-48
• 第四章 添加不同重金屬對于多重質(zhì)粒pYN1在不同細(xì)菌種屬之間自然轉(zhuǎn)化的影響的研究48-64
• 4.1 前言48-50
• 4.2 材料和方法50-53
• 4.2.1 材料50
• 4.2.2 化學(xué)試劑50
• 4.2.3 培養(yǎng)基50-51
• 4.2.4 常用實驗儀器51
• 4.2.5 實驗技術(shù)路線51-52
• 4.2.6 轉(zhuǎn)化子計數(shù)52
• 4.2.7 SDS-PAGE檢測不同處理狀態(tài)下枯草芽孢桿菌全蛋白的表達(dá)52-53
• 4.2.8 高效液相53
• 4.3 結(jié)果和分析53-61
• 4.3.1 受體菌對重金屬最小抑菌濃度53-54
• 4.3.2 不同銅離子濃度對多抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響54-55
• 4.3.3 不同錳離子濃度對多抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響55
• 4.3.4 不同鋅離子濃度對多抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響55-57
• 4.3.5 不同鐵離子濃度對多抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響57-58
• 4.3.6 不同重金屬對枯草芽孢桿菌生長狀態(tài)以及蛋白表達(dá)量的影響58
• 4.3.7 不同重金屬對變形桿菌生長狀態(tài)以及蛋白表達(dá)量的影響58-59
• 4.3.8 SDS-PAGE檢測不同處理狀態(tài)下枯草芽孢桿菌全蛋白的表達(dá)59
• 4.3.9 高效液相對于不同重金屬處理條件下菌體全蛋白的表達(dá)檢測59-61
• 4.4 小結(jié)61-64
• 第五章 GFP標(biāo)記多重耐藥質(zhì)粒pYN164-76
• 5.1 前言64-65
• 5.2 材料和方法65-72
• 5.2.1 材料65-66
• 5.2.2 化學(xué)試劑66-67
• 5.2.3 培養(yǎng)基67
• 5.2.4 常用實驗儀器67
• 5.2.5 實驗技術(shù)路線67
• 5.2.6 GFP基因的克隆67-69
• 5.2.7 質(zhì)粒pYN1的提取69-70
• 5.2.8 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)制備70-71
• 5.2.9 熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞71
• 5.2.10 質(zhì)粒pYN2的構(gòu)建71-72
• 5.3 結(jié)果和分析72-74
• 5.3.1 轉(zhuǎn)化子的平板驗證與熒光顯微鏡檢測72-73
• 5.3.2 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性檢測73-74
• 5.3.3 GFP驗證74
• 5.4 小結(jié)74-76
• 第六章 結(jié)論與展望76-78
• 6.1 結(jié)論76
• 6.2 展望76-78
• 參考文獻(xiàn)78-86
• 致謝86-88
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄88-89

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本文編號：372939