金黃色葡萄球菌作為人類重要的致病菌,能引起多種感染。附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)作為毒力因子的調(diào)控系統(tǒng),在其致病過程中發(fā)揮著重要作用。該系統(tǒng)包含一個(gè)雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（AgrC/AgrA）,AgrC負(fù)責(zé)感知外源信號(hào)刺激并將信號(hào)傳遞到胞內(nèi)的AgrA,磷酸化后的AgrA可以特異性的與下游啟動(dòng)子P2P3之間的序列結(jié)合,并進(jìn)而引起相關(guān)毒力因子的表達(dá)與釋放。體外研究表明,AgrA異源表達(dá)過程中,往往在獲得高水平表達(dá)的同時(shí),容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵體,不利于目的蛋白功能活性的研究。并且,膜蛋白AgrC在細(xì)胞膜上具有拓?fù)淙∠蛐?使得在體外研究雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)變得更加困難。因此,欲對(duì)金黃色葡萄球菌雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究,首先需要解決AgrA可溶性表達(dá)的問題和AgrC在人工膜中的取向問題。該研究將為體外篩選和開發(fā)抗金黃色葡萄球菌感染的新藥奠定一定基礎(chǔ)。首先,采用無限制克隆法構(gòu)建AgrA表達(dá)載體,在AgrA蛋白的C端融合綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽,通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)GFP的熒光強(qiáng)度來快速檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)水平。利用單因素實(shí)驗(yàn)篩選出宿主菌株;然后,結(jié)合Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選出最優(yōu)蛋白表達(dá)條件。其次,... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 金黃色葡萄球菌的耐藥性
    1.2 細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)
        1.2.1 細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)介
        1.2.2 金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)系統(tǒng)
        1.2.3 AgrC
        1.2.4 AgrA
        1.2.5 AIP信號(hào)分子
    1.3 人工細(xì)胞膜體系簡(jiǎn)介
        1.3.1 脂質(zhì)體
        1.3.2 蛋白脂質(zhì)體
    1.4 本研究工作的內(nèi)容和意義
第二章 金黃色葡萄球菌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白AgrA的表達(dá)與純化
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒
        2.2.2 主要儀器與設(shè)備
        2.2.3 主要試劑與規(guī)格
        2.2.4 培養(yǎng)基與溶液配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 AgrA-GFP蛋白異源表達(dá)體系的優(yōu)化
        2.3.3 GFP熒光測(cè)定
        2.3.4 AgrA-GFP與AgrA蛋白的純化
        2.3.5 SDS-PAGE電泳與Western blot檢測(cè)
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 重組表達(dá)載體pET-28a(+)-AgrA和pET-28a(+)-AgrA-GFP的構(gòu)建
        2.4.2 表達(dá)菌株的篩選
        2.4.3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)法優(yōu)化蛋白表達(dá)條件
        2.4.4 AgrA-GFP和AgrA蛋白的表達(dá)與純化
        2.4.5 討論
第三章 受體蛋白AgrC跨膜鑲嵌的人工細(xì)胞膜體系的構(gòu)建及其評(píng)價(jià)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        3.2.2 主要儀器與設(shè)備
        3.2.3 主要試劑與規(guī)格
        3.2.4 培養(yǎng)基與溶液配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 蛋白的表達(dá)與純化
        3.3.2 脂質(zhì)體的制備
        3.3.3 脂質(zhì)體的表征
        3.3.4 蛋白脂質(zhì)體的制備
        3.3.5 AgrC蛋白脂質(zhì)體中AgrC取向分析
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 最佳緩沖體系的篩選
        3.4.2 帶負(fù)電磷脂比例和膽固醇含量對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響
        3.4.3 最佳鑲嵌比例的確定
        3.4.4 蛋白脂質(zhì)體中AgrC取向分析
        3.4.5 討論
第四章 AgrC/AgrA雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型的構(gòu)建與EMSA評(píng)價(jià)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 主要儀器與設(shè)備
        4.2.2 主要試劑與規(guī)格
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 AgrA蛋白活性檢測(cè)
        4.3.2 AgrC激酶活性的測(cè)定
        4.3.3 AgrC/AgrA雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型的構(gòu)建
        4.3.4 啟動(dòng)子P2P3核心序列的復(fù)性
        4.3.5 AgrC/AgrA雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型的EMSA檢測(cè)
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 AgrA蛋白活性的檢測(cè)
        4.4.2 AgrC蛋白活性的驗(yàn)證
        4.4.3 復(fù)性后P2P3核心序列的檢測(cè)
        4.4.4 AgrC/AgrA雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型的EMSA檢測(cè)
        4.4.5 AgrC對(duì)EMSA實(shí)驗(yàn)的影響
        4.4.6 討論
第五章 總結(jié)與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[6]GFP與微管結(jié)合蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)融合蛋白載體構(gòu)建與表達(dá)[J]. 胡建廣,尹艷.  中國(guó)生物工程雜志. 2004(01)
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[8]在大腸桿菌表達(dá)體系中以包涵體形式存在的真核生物蛋白質(zhì)的分離、復(fù)性和二硫鍵的形成[J]. 陳來同,茹炳根.  中國(guó)生化藥物雜志. 1997(01)

碩士論文
[1]脂質(zhì)體Na+、K+Gibbs-Donnan平衡與振蕩現(xiàn)象[D]. 晏芳.浙江工商大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3711947