本文關(guān)鍵詞：四環(huán)素調(diào)控人Numb基因過表達(dá)慢病毒載體的分步構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本課題旨在構(gòu)建含有四環(huán)素調(diào)控人Numb基因過表達(dá)調(diào)控組份的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒載體,以及構(gòu)建含有四環(huán)素調(diào)控人Numb基因過表達(dá)反應(yīng)組份的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒載體,并測定它們的滴度,為Numb調(diào)控人干細(xì)胞“干性”的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1、采用酶切技術(shù)將Lenti-egfp-IRES-puro載體酶切后獲得Lenti-IRES-puro骨架。采用凝膠電泳技術(shù)驗(yàn)證rtta基因片段。將rtta基因片段連接到Lenti-IRES-puro骨架上得到Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增,提取質(zhì)粒通過酶切及基因測序驗(yàn)證后,將Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒、輔助包裝質(zhì)粒delta、pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,分別在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒及濃縮病毒。將病毒稀釋后感染293T細(xì)胞,48小時(shí)后,通過ELISA方法測定其滴度。2、使用酶切技術(shù)將Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4載體酶切后獲得Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架。使用RT-PCR技術(shù)從人胚胎干細(xì)胞總RNA中獲得人Numb基因片段,將人Numb基因片段連接到Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架上得到Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增,提取質(zhì)粒通過酶切及基因測序驗(yàn)證后,將Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒、輔助包裝質(zhì)粒delta、pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,分別在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒及濃縮病毒。將病毒稀釋后感染293T細(xì)胞,48小時(shí)后,通過DAPI細(xì)胞染色方法測定其滴度。結(jié)果:1、Lenti-egfp-IRES-puro載體經(jīng)酶切行瓊脂糖凝膠電泳后,觀察到有兩條條帶,顯示Lenti-IRES-puro骨架獲取成功。rtta基因片段行瓊脂糖凝膠電泳后,觀察到在1kbp附近有條帶,顯示rtta基因片段獲取成功�？寺〉腖enti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒經(jīng)酶切行瓊脂糖凝膠電泳,觀察到有兩條條帶,經(jīng)基因測序結(jié)果為100%正確,顯示Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,感染后48小時(shí)收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒濃縮液滴度為:6.5*10^7TU/ml,感染后72小時(shí)收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒濃縮液滴度為:5.7*10^7TU/ml。2、Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4載體經(jīng)酶切后行瓊脂糖凝膠電泳,觀察到有兩條條帶,顯示Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架獲取成功。采用RT-PCR技術(shù)從人胚胎干細(xì)胞總RNA中獲取人Numb基因片段行瓊脂糖凝膠電泳后,觀察到在2kbp處有條帶,顯示人Numb基因片段獲取成功�？寺〉腖enti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后行瓊脂糖凝膠電泳,觀察到有兩條條帶,經(jīng)基因測序結(jié)果為100%正確,顯示Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,感染后48小時(shí)收集的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb病毒濃縮液滴度為:3.5*10^7TU/ml,感染后72小時(shí)后收集的LentiEF1a-EGFP-TRE-Numb病毒濃縮液滴度為:2.5*10^7TU/ml。結(jié)論:1、含有四環(huán)素調(diào)控人Numb基因過表達(dá)調(diào)控組份的Lenti-EF1a-RTTA-IRE S-Puro慢病毒載體構(gòu)建成功。2、含有四環(huán)素調(diào)控人Numb基因過表達(dá)反應(yīng)組份的Lenti-EF1a-EGFP-TRENumb慢病毒載體構(gòu)建成功。
【關(guān)鍵詞】：Numb基因 四環(huán)素 過表達(dá) 慢病毒 干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料13-15
• 2.1 主要儀器及設(shè)備13
• 2.2 細(xì)胞來源13
• 2.3 主要試劑13-14
• 2.4 試劑的配制14-15
• 第3章 LENTI-EF1A-RTTA-IRES-PURO慢病毒載體的構(gòu)建及其滴度測定15-25
• 3.1 Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro質(zhì)粒的構(gòu)建15-22
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)方法15-19
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-22
• 3.2 Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒的包裝及滴度測定22-25
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-25
• 第4章 LENTI-EF1A-EGFP-TRE-NUMB慢病毒載體的構(gòu)建及其滴度測定25-34
• 4.1 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb質(zhì)粒的構(gòu)建25-31
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-31
• 4.2 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒的包裝及滴度測定31-34
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-34
• 第5章 討論34-39
• 5.1 Numb 拮抗 Notch 信號通路34-35
• 5.2 Tet-on系統(tǒng)35-36
• 5.3 Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒載體36-37
• 5.4 Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒載體37-39
• 第6章 結(jié)論與展望39-40
• 6.1 結(jié)論39
• 6.2 展望39-40
• 致謝40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果43-44
• 綜述44-49
• 參考文獻(xiàn)48-49

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：370514