本文關(guān)鍵詞：貝伐株單克隆抗體制備工藝及質(zhì)量研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：貝伐株單克隆抗體是美國第一個(gè)獲得批準(zhǔn)上市的抑制腫瘤血管生成的藥,用于多種癌癥的治療。本課題的目的是研究開發(fā)貝伐株單克隆抗體的制備工藝,并通過質(zhì)量研究確證其分子結(jié)構(gòu)、質(zhì)量屬性及穩(wěn)定性,為商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ),進(jìn)而使國人能夠獲得用得起的國產(chǎn)良藥,提高患者的生活質(zhì)量。采用重組DNA技術(shù),人工合成貝伐株單克隆抗體重鏈與輕鏈基因,將此克隆的重鏈與輕鏈基因片段分別插入到自行構(gòu)建的一種高效逆轉(zhuǎn)錄病毒前載體,將獲得重鏈表達(dá)前載體和輕鏈表達(dá)前載體分別與病毒包裝質(zhì)粒p HCMV-G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293GP,制備獲得兩種分別攜帶有貝伐株單克隆抗體重鏈與輕鏈基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體先后交替轉(zhuǎn)導(dǎo)CHO-S細(xì)胞,獲得可穩(wěn)定表達(dá)貝伐株單克隆抗體的工程細(xì)胞。應(yīng)用先進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),經(jīng)過細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)和發(fā)酵表達(dá)培養(yǎng),在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生貝伐珠單抗,然后采用包括病毒滅活和去除步驟在內(nèi)的純化工藝進(jìn)行純化,再經(jīng)過配制、除菌過濾、無菌灌裝等制劑生產(chǎn)工藝獲得成品。通過多次實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)工藝、純化工藝及制劑生產(chǎn)工藝的各個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行不斷的摸索和優(yōu)化,最終確定了高效表達(dá)貝伐株單克隆抗體的生產(chǎn)工藝。并對(duì)該工藝條件下生產(chǎn)出來的原液和成品進(jìn)行了質(zhì)量分析和穩(wěn)定性研究,各檢測結(jié)果均合格,工程細(xì)胞株傳代穩(wěn)定性良好,細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)量高,純化工藝獲得的原液純度高,本品7批中試原液和成品的質(zhì)量研究表明本品批間高度一致;和上市對(duì)照品AVASTIN#174;的一級(jí)氨基酸序列完全一致,在模仿AVASTIN#174;制劑處方的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的處方優(yōu)于AVASTIN#174;的處方。3批結(jié)構(gòu)確證和質(zhì)量屬性(其中N-糖糖譜分析、糖基化位點(diǎn)分析、二硫鍵配對(duì)分析為1批)研究結(jié)果表明本品批間高度一致性且和上市對(duì)照品高度相似。本課題研究獲得的貝伐株單克隆抗體高效表達(dá)的制備工藝可實(shí)現(xiàn),且能夠持續(xù)穩(wěn)定的生產(chǎn)出與原研藥高度相似的產(chǎn)品,該制備工藝可以用于規(guī)�；a(chǎn),本項(xiàng)目可以進(jìn)一步開展臨床申報(bào)工作。
【關(guān)鍵詞】：重組DNA技術(shù) 單克隆抗體 工程細(xì)胞 質(zhì)量屬性 高度相似
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 提要4-5
• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 英文縮略詞表8-14
• 引言14-15
• 第1章 綜述15-20
• 1.1 抗體藥物的發(fā)展歷程15-16
• 1.2 抗體藥物的應(yīng)用進(jìn)展16-17
• 1.3 貝伐株單抗的臨床應(yīng)用17-18
• 1.4 貝伐株單抗的研究進(jìn)展18-19
• 1.5 貝伐株單抗制備工藝的研究思路19-20
• 第2章 貝伐株單克隆抗體制備工藝研究20-69
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20
• 2.1.1 主要試劑與耗材20
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-31
• 2.2.1 工程細(xì)胞的構(gòu)建和鑒定20-21
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)工藝研究21-28
• 2.2.2.1 培養(yǎng)基成分的篩選21-22
• 2.2.2.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化22-27
• 2.2.2.3 細(xì)胞生長和產(chǎn)物分泌規(guī)律27
• 2.2.2.4 接種量研究27
• 2.2.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化和確定27-28
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)工藝的放大28
• 2.2.3.1 細(xì)胞放大體積（倍數(shù)）28
• 2.2.3.2 控制參數(shù)的放大28
• 2.2.4 純化工藝研究28-30
• 2.2.4.1 樣品粗分離28-29
• 2.2.4.2 超濾濃縮及緩沖液置換29
• 2.2.4.3 Mabselect Sure親和層析29
• 2.2.4.4 低p H孵放法滅活病毒29
• 2.2.4.5 Q-FF陰離子交換層析29
• 2.2.4.6 陽離子交換層析29-30
• 2.2.4.7 納濾法除病毒過濾30
• 2.2.5 純化工藝的放大30
• 2.2.6 制劑工藝研究30-31
• 2.2.6.1 制劑配方的選擇與確定30-31
• 2.2.6.2 制劑穩(wěn)定性研究31
• 2.3 結(jié)果與討論31-69
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)工藝研究31-44
• 2.3.1.1 培養(yǎng)基的篩選31-33
• 2.3.1.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化33-39
• 2.3.1.3 細(xì)胞生長和產(chǎn)物分泌規(guī)律39-40
• 2.3.1.4 接種量研究40-41
• 2.3.1.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化和確定41-44
• 2.3.2 純化工藝研究44-65
• 2.3.2.1 樣品粗分離44
• 2.3.2.2 超濾濃縮及緩沖液置換44-45
• 2.3.2.3 Mabselect Sure親和層析45-49
• 2.3.2.4 低p H孵放法滅活病毒49-52
• 2.3.2.5 Q-FF陰離子交換層析52-55
• 2.3.2.6 陽離子交換層析55-64
• 2.3.2.7 納濾法除病毒過濾64-65
• 2.3.3 純化工藝的放大65-66
• 2.3.3.1 固液分離的參數(shù)放大66
• 2.3.3.2 純化層析柱參數(shù)的放大66
• 2.3.3.3 純化層析操作參數(shù)的放大66
• 2.3.4 制劑工藝研究66-69
• 2.3.4.1 制劑配方的確定66
• 2.3.4.2 制劑穩(wěn)定性研究66-69
• 第3章 貝伐株單克隆抗體質(zhì)量研究69-112
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料69
• 3.1.1 主要試劑與耗材69
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備69
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法69-80
• 3.2.1 貝伐株單抗原液質(zhì)量研究69-74
• 3.2.1.1 p H值69-70
• 3.2.1.2 蛋白質(zhì)含量[25]70
• 3.2.1.3 生物學(xué)活性[26]70-71
• 3.2.1.4 還原型電泳純度71
• 3.2.1.5 非還原型電泳純度71
• 3.2.1.6 純度（分子排阻色譜法）71
• 3.2.1.7 電荷異構(gòu)體（離子交換色譜法）71-72
• 3.2.1.8 賴氨酸變體（離子交換色譜法）72
• 3.2.1.9 分子量72
• 3.2.1.10 紫外光譜掃描72-73
• 3.2.1.11 等電點(diǎn)73
• 3.2.1.12 外源性DNA殘留量（q PCR法）73
• 3.2.1.13 CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量[27]73
• 3.2.1.14 蛋白A殘留量73-74
• 3.2.1.15 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查74
• 3.2.1.16 肽圖74
• 3.2.2 貝伐株單抗成品質(zhì)量研究74-78
• 3.2.2.1 鑒別實(shí)驗(yàn)75
• 3.2.2.2 外觀75
• 3.2.2.3 可見異物75
• 3.2.2.4 不溶性微粒檢查75
• 3.2.2.5 滲透壓摩爾濃度75
• 3.2.2.6 裝量75
• 3.2.2.7 pH值75
• 3.2.2.8 聚山梨酯80含量75
• 3.2.2.9 蛋白質(zhì)含量75-76
• 3.2.2.10 生物學(xué)活性76
• 3.2.2.11 還原型電泳純度76
• 3.2.2.12 非還原型電泳純度76-77
• 3.2.2.13 純度（分子排阻色譜法）77
• 3.2.2.14 電荷異構(gòu)體（離子交換色譜法）77
• 3.2.2.15 賴氨酸變體（離子交換色譜法）77-78
• 3.2.2.16 無菌檢查78
• 3.2.2.17 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查78
• 3.2.2.18 異常毒性檢查78
• 3.2.3 原液穩(wěn)定性研究[28]78-79
• 3.2.4 成品穩(wěn)定性研究79-80
• 3.3 結(jié)果與討論80-112
• 3.3.1 貝伐株單抗原液質(zhì)量研究80-96
• 3.3.1.1 p H值80-81
• 3.3.1.2 蛋白質(zhì)含量81-82
• 3.3.1.3 生物學(xué)活性82-84
• 3.3.1.4 還原型電泳純度84-85
• 3.3.1.5 非還原型電泳純度85
• 3.3.1.6 純度（分子排阻色譜法）85-86
• 3.3.1.7 電荷異構(gòu)體（離子交換色譜法）86-88
• 3.3.1.8 賴氨酸變體（離子交換色譜法）88
• 3.3.1.9 分子量88-90
• 3.3.1.10 紫外光譜掃描90
• 3.3.1.11 等電點(diǎn)90
• 3.3.1.12 外源性DNA殘留量（q PCR法）90-91
• 3.3.1.13 CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量91-92
• 3.3.1.14 蛋白A殘留量92-93
• 3.3.1.15 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查93-94
• 3.3.1.16 肽圖94-96
• 3.3.2 貝伐株單抗成品質(zhì)量研究96-109
• 3.3.2.1 鑒別實(shí)驗(yàn)96
• 3.3.2.2 外觀96
• 3.3.2.3 可見異物96-97
• 3.3.2.4 不溶性微粒檢查97-98
• 3.3.2.5 滲透壓摩爾濃度98-99
• 3.3.2.6 裝量99
• 3.3.2.7 p H值99-100
• 3.3.2.8 聚山梨酯80含量100
• 3.3.2.9 蛋白質(zhì)含量100-101
• 3.3.2.10 生物學(xué)活性101-102
• 3.3.2.11 還原型電泳純度102-103
• 3.3.2.12 非還原型電泳純度103
• 3.3.2.13 純度（分子排阻色譜法）103-104
• 3.3.2.14 電荷異構(gòu)體（離子交換色譜法）104-105
• 3.3.2.15 賴氨酸變體（離子交換色譜法）105-106
• 3.3.2.16 無菌檢查106
• 3.3.2.17 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查106-107
• 3.3.2.18 異常毒性檢查107-109
• 3.3.3 貝伐株單抗原液穩(wěn)定性研究109-110
• 3.3.3.1 反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)109
• 3.3.3.2 貝伐珠單抗原液加速實(shí)驗(yàn)109-110
• 3.3.3.3 貝伐株單抗原液長期實(shí)驗(yàn)110
• 3.3.4 貝伐株單抗成品穩(wěn)定性研究110-112
• 3.3.4.1 光照實(shí)驗(yàn)110
• 3.3.4.2 高溫實(shí)驗(yàn)110-111
• 3.3.4.3 凍融實(shí)驗(yàn)111-112
• 第4章 結(jié)論112-117
• 4.1 生產(chǎn)用原材料研究112
• 4.2 原液生產(chǎn)工藝研究112-113
• 4.3 制劑處方及工藝研究113-114
• 4.4 質(zhì)量研究及穩(wěn)定性研究114-115
• 4.4.1 質(zhì)量研究114
• 4.4.2 穩(wěn)定性研究114-115
• 4.4.2.1 原液穩(wěn)定性114
• 4.4.2.2 成品穩(wěn)定性114-115
• 4.4.3 結(jié)構(gòu)確證和質(zhì)量屬性研究115
• 4.5 綜合分析和評(píng)價(jià)115-117
• 參考文獻(xiàn)117-119
• 作者簡介119-120
• 致謝120

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 胡春艷;劉全忠;;單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

2 馮潔;;介紹幾種抗腫瘤的靶向新藥[J];中國藥師;2006年02期

  本文關(guān)鍵詞：貝伐株單克隆抗體制備工藝及質(zhì)量研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：359385